血管平滑肌细胞的增殖及西洋参叶二醇组皂苷的干预作用

　　　　　　 作者：邵伟 袁晓波　王智昊 赵学忠

【摘要】 目的 观察西洋参叶二醇组皂苷（PQDS）对增殖的血管平滑肌细胞（VSMC）的干预作用，探讨PQDS干预VSMC的增殖作用及机制。方法 组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMC，用AngII诱导VSMC增殖。随机分为：空白对照组、AngⅡ模型组、AngⅡ+PQDS 100、50、25 mg/L不同剂量组。用MTT法、流式细胞术观察PQDS对细胞增殖、细胞周期、增殖指数的影响。结果 PQDS可减低VSMC的增殖能力，将增殖的VSMC抑制在G0/G1期。结论 PQDS能抑制VSMC增殖，其机制可能与将增殖的VSMC抑制在G0/G1期有关。

【关键词】 西洋参叶二醇组皂苷；血管平滑肌细胞；血管紧张素II

冠状动脉粥样硬化（AS）的主要病理变化是血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖〔1，2〕。诱导VSMC增殖因素有很多，其中较重要的因素为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）。AngⅡ是肾素血管紧张素系统（RAS）中重要的生物活性肽，经过一系列细胞信号转导可诱导细胞增殖〔3〕。西洋参叶二醇组皂苷（PQDS）是五加科人参属植物，有抗心肌缺血、缩小心肌梗死面积的作用〔4〕。目前尚未有文献报道PQDS对VSMC增殖的影响，本文就PQDS对VSMC增殖的干预作用进行研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂及材料

　　Wistar大鼠3只，雄性，120～150 g。PQDS粉末、AngⅡ（Sigma公司），胎牛血清FBS、RPMI1640培养基、Trizol（Gibco公司），兔抗大鼠平滑肌肌动蛋白（αSMA）（美国Lab vision公司），SP抗兔试剂盒、DAB显色试剂盒（中杉金桥生物工程有限公司），MTT、碘化丙锭、RNA酶（Sigma分装）。

　　1.2 VSMC的培养及鉴定

　　用组织贴块法进行中层VSMC培养，当细胞铺满培养瓶底80%以上时，传代培养，取第3～6代培养物，经兔抗大鼠αSMA免疫组化染色鉴定，阳性细胞＞98%，证实培养的是VSMC，实验用5～10代VSMC。

　　1.3 分组

　　将细胞随机分为5组，空白对照组：正常VSMC组；AngⅡ模型组：AngⅡ 10-7 mol/L，PQDS高剂量组（PQDS1）：PQDS 100 mg/L+ AngⅡ 10-7 mol/L； PQDS中剂量组（PQDS2）：PQDS 50 mg/L+ AngⅡ 10-7 mol/L；PQDS低剂量组（PQDS3）：PQDS 25 mg/L+ AngⅡ 10-7 mol/L；以上各组细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。

　　1.4 MTT法检测细胞增殖能力

　　用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为200 μl。将培养板放入CO2孵箱中37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，培养24 h，待培养细胞贴壁后，吸去培养液。按照上述分组中的给药，各组细胞在10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于CO2孵箱中37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，培养48 h。弃去培养液，每孔加入MTT溶液20 μl，37℃继续培养4 h后终止培养，吸弃培养上清液，每孔加150 μl二甲基亚枫（DMSO），振荡10 min。然后选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期及增殖指数

　　将细胞接种在培养瓶中，培养24 h，后换无血清RPMI1640培养液作用24 h，使细胞同步化于G0期。按前述分组方案加药处理后，继续培养48 h，然后收集细胞，离心1 000 r/min×5 min，弃上清。用4℃预冷的70%冷乙醇固定18 h，之后调整细胞浓度为1×106细胞/ml，PI染色37℃孵育30 min后进行流式分析，应用ModFit LT3.0软件分析细胞周期中各期细胞所占总细胞的百分率；计算细胞增殖指数（PI），PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS软件进行统计处理，所有计量数据以x±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）、SNK检验进行差异的统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 VSMC的鉴定

　　用倒置相差显微镜和SMA免疫组化染色，对VSMC进行鉴定。细胞培养3～5 d后，用相差显微镜观察可见少量细胞自组织块边缘游离出来，细胞呈梭形或长梭形排列，然后细胞呈放射性生长，长轴与组织块边缘垂直，多为两极，胞浆均匀，可见圆形细胞核及分裂相。至培养10 d左右出现局部成束的细胞平行排列，部分区域细胞重叠，部分区域高低起伏呈“峰、谷”状生长。SMA染色发现>98%的细胞染色呈阳性，即细胞浆内呈现棕黄色反应，胞核不着色，表明细胞含有SMA，证明培养的细胞为VSMC。见图1。

　　2.2 PQDS对VSMC增殖能力的干预

　　AngⅡ模型组OD值(0.862 5±0.06)比空白对照组(0.791 3±0.04)明显升高（P<0.05），提示AngⅡ可促进VSMC的增殖，造模成功。PQDS高、中剂量组OD值(0.773 8±0.05，0.807 5±0.03)比AngⅡ模型组均显著降低（P<0.05），PQDS低剂量组(0.812 5±0.06)有下降趋势，但是没有统计学意义（P>0.05），提示PQDS能够抑制VSMC增殖。

　　2.3 PQDS 对VSMC的细胞周期及PI的干预

　　AngⅡ模型组较空白对照组G0/G1期VSMC百分率明显减少（P<0.05），S期、G2/M期VSMC百分率显著增加（P<0.05），增殖指数明显升高（P<0.05）。提示AngⅡ可以促进VSMC从G1/G0期向S期转化，诱导VSMC增殖，造模成功。PQDS药物组较AngⅡ模型组G0/G1期的VSMC百分率均显著增加（P<0.05）；S期的VSMC百分率、增殖指数均显著减少（P<0.05）；PQDS高、中剂量组G2/M期VSMC百分率显著降低（P<0.05），低剂量组G2/M期百分率降低，但没有明显差异（P>0.05）。上述结果显示PQDS干预AngⅡ诱导的VSMC增殖，主要将细胞抑制在G1/G0期，见表1。表1 PQDS对细胞周期及增殖指数的影响(略)

　　3 讨 论

　　目前临床上抑制VSMC增殖的药物有钙离子拮抗剂、β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、免疫抑制剂雷帕霉素、降脂药普罗布考等〔5〕，但抑制VSMC增殖的中药开发得较少。中药是祖国医药的神奇宝藏，在中医整体理论的指导下，可发挥多靶点、多成分协同作用的优势，疗效显著、价格低廉、毒副作用小。因此，开发抑制VSMC增殖的安全有效的中药及探讨抑制VSMC增殖的机制有重要意义。
　　
　　AngⅡ是肾素血管紧张素系统中最重要的生物活性肽，不仅是血管活性物质引起机体血流动力学改变，而且通过自分泌、旁分泌刺激VSMC增殖〔6〕。本实验用AngⅡ诱导VSMC增殖，MTT法观察到AngⅡ模型组OD值比空白对照组明显增高，说明AngⅡ促进VSMC增殖，表明实验造模成功。本文通过流式细胞仪技术，发现AngⅡ 使G0/G1期的VSMC百分率明显减少，S期、G2/M期的VSMC百分率明显增加。证实AngⅡ促使VSMC从G0/G1期进入到S期、G2/M期，诱导细胞增殖。
　　
　　西洋参茎叶皂苷（PQS）系五加科人参属植物，包括PQDS和三醇组皂苷等。研究证明PQDS可增加急性心肌梗死犬心肌血流量，降低冠脉阻力，明显降低心肌耗氧量、心肌氧摄取率及心肌耗氧指数〔7〕，可增加小鼠心肌 Rb摄取率，增加心肌营养性血流量〔8〕，可明显缩小心肌梗死面积，减少血清中肌酸磷酸激酶（CPK）及乳酸脱氢酶（LDH） 活性〔9〕 。本实验证明PQDS对VSMC增殖有抑制作用。PQDS组OD值明显比AngⅡ组减低，说明PQDS可抑制细胞增殖。PQDS各组可增加G0/G1期VSMC的百分率，减少S期、G2/M期VSMC的百分率，减少增殖指数，阻断细胞由G0/G1期向DNA合成的S期、G2/M期转化。说明PQDS可抑制VSMC的增殖，可将VSMC细胞抑制在G0/G1期，进而证明PQDS通过抑制VSMC增殖而起到对AS的防治作用。

参考文献

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　　8 翟丽杰，于小风，曲绍春，等. 西洋参叶 20s原人参二醇组皂苷对小鼠心肌营养性血流量的影响〔J〕.人参研究，2004；4:24.

　　9 武淑芳，睢大员，于晓凤，等.西洋参叶 20s原人参二醇组皂苷抗实验性心肌缺血作用及其机制〔J〕.中国药理学杂志，2002；37(2):1003.