辛伐他汀对T淋巴细胞炎症反应的影响

　　　　　　 作者：马晶 胡春燕 蒋庆渊 黄波 蔡振荣

【摘要】 目的 探讨他汀类药物对T淋巴细胞的抗炎机制。方法 体外培养人外周血T淋巴细胞，用不同浓度辛伐他汀进行处理，实时荧光定量PCR法检测T细胞肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素2（IL2）表达水平，免疫细胞化学SP法检测T细胞核因子kappaB（NFκB）移位情况。结果 辛伐他汀呈剂量依赖性抑制TNFα、IL2表达（P＜0.05），抑制NFκB移位入核（P＜0.05），且10 μmol/L辛伐他汀在作用24 h时作用最明显。结论 辛伐他汀可对T淋巴细胞有抗炎作用，且可能是通过抑制NFκB的转位入核实现的。

【关键词】 辛伐他汀；T淋巴细胞；肿瘤坏死因子α；白细胞介素2；核因子kappaB

近年来普遍认为，炎症反应在心力衰竭(HF)进展中起重要作用。HF的炎症反应与机体的细胞免疫功能紊乱有关，T淋巴细胞在炎症反应中起着重要的作用。辛伐他汀是3羟3甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，其抗炎作用日益受重视。研究发现，他汀类药物可以改善HF患者的心功能及预后与其抗炎作用有关〔1，2〕。该作用的确切机制以及不同剂量的他汀类药物作用是否有差别，目前少有报道。前瞻性研究认为他汀类药物对HF治疗无明显疗效〔3〕。本实验采用体外细胞培养方法，研究不同浓度的辛伐他汀对T细胞肿瘤坏死因子（TNFα）、白细胞介素2（IL2）表达分泌以及胞核细胞核因子kappaB（NFκB）移位情况的影响，为今后将他汀类药物用于临床HF患者的治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂和材料

　　植物血凝素（PHA）购自Sigma公司，用RPMI1640全培养基稀释，使用终浓度为5 μg/ml。辛伐他汀购自默沙东公司，用无水乙醇助溶。PCR试剂盒购自Promega公司。引物由大连宝生物工程有限公司合成。抗兔抗NFκB（p65）多克隆抗体购自Neomarkers公司。人外周血T淋巴细胞（Jurkat）购自中国科学院上海细胞生物所。

　　1.2 实验分组

　　Jurkat细胞用含10％新生牛血清的RPMI1640培养液37℃、5％ CO2条件下培养。取状态良好时的细胞接种于24孔培养板中，分为①空白组：加等量生理盐水；②刺激剂组：加5 μg/ml PHA；③～⑤药物干预组：分别加辛伐他汀1、5、10 μmol/L三个浓度，加药顺序为先加入辛伐他汀，2 h后再加PHA。调整细胞浓度至4×106/ml，培养4、24、48、72 h后收集细胞或上清液检测。

　　1.3 实时荧光定量PCR检测T细胞TNFα、IL2的表达

　　利用总RNA提取试剂（Trizol试剂）提取细胞总RNA。根据说明使用20 μl混和体系进行反应，逆转为cDNA后进行荧光探针标记的实时定量PCR。反应体系25 μl，进行40个循环。反应停止，以GAPDH作为内参照测定Ct值。各引物序列：TNFα上游：5′ACA ACC CTC AGA CGC CAC AT3′，下游：5′CAG GGC AAT GAT CCC AAA GT3′；IL2上游：5′TTC CAA AGA GTC ATC AGA AGA GGA3′ ，下游：5′GGC CTG ATA TGT TTT AAG TGG GA3′；GAPDH上游：5′GCC TCC CGC TTC GCT CTC3′，下游：5′TTG GCC AGG GGT GCT AAG3′。反应条件：95℃预变性10 min后，95℃变性5 s→60℃退火34 s，共计40个循环。取10 μl PCR反应产物进行1.5%琼脂电泳，光密度扫描后图片经Image软件分析，结果以目的基因与同时扩增的内参的PCR扩增产物Ct值的比值来表达TNFα、IL2的相对表达量。

　　1.4 SP法检测辛伐他汀体外对T细胞NFκB的影响

　　一抗为鼠抗NFκB p65单克隆抗体，二抗为生物素标记羊抗小鼠IgG，DAB显色。对照实验用PBS代替一抗。胞核中出现清晰棕黄色颗粒判定为阳性。每张涂片随机计数3个视野，计算胞核阳性细胞数占细胞总数的百分比作为该份标本的阳性率。

　　1.5 统计学方法

　　应用SPSS 11.0 软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，各组间比较用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 辛伐他汀对T细胞TNFα、IL2产生的影响

　　与PHA刺激组比较，辛伐他汀作用后，T细胞产生TNFα、IL2减少，并且随辛伐他汀浓度增加，改变程度越明显（P＜0.05）。且10 μmol/L辛伐他汀在作用24 h时对TNFα、IL2作用最明显（P＜0.05）。见表1。表1 T细胞TNFα和IL2表达水平（略)

　　2.2 辛伐他汀对T细胞NFκB的影响

　　与PHA刺激组比较，辛伐他汀作用后，T细胞明显抑制NFκB转位入核，并且随浓度增加，抑制程度越明显（P＜0.05）。且10 μmol/L辛伐他汀在作用24 h时该抑制作用最明显（P＜0.05）。见表2。表2 T细胞胞核内NFκB阳性率（略)

　　3 讨 论

　　临床随机研究显示，他汀类药物可显著抑制HF患者体内的炎症状态，改善内皮功能，并提高心功能〔4〕。Azuma等〔5〕研究发现氟伐他汀抑制IFNγ、IL2，灭活NFκB，从而抑制自身免疫型心肌炎鼠的T细胞反应。
　　
　　活化的辅助性T淋巴细胞（Th）按其分泌细胞因子不同可分为两群:Th1细胞分泌IFNγ、TNFα、IL2；Th3细胞分泌IL4、IL5、IL10。HF患者存在Th1亢进，Th3却不能相应增加，出现Th1 /Th3失衡。Yu等〔6〕通过对其建立的免疫调节基因缺失的动物模型研究证明Th1亢进可以加速HF动物的心室重构。本研究结果表明辛伐他汀对Th1分泌的TNFα、IL2有抑制作用，且该作用与辛伐他汀浓度成正比，提示对Th1的免疫反应有抑制作用且成剂量相关性。
　　
　　NFκB参与多种炎症介质和细胞因子基因的表达调控，是炎症性疾病的关键因子之一。非活化状态的NFκB位于胞浆中，活化后则主要位于胞核内，检测胞核NFκB移位情况可了解NFκB的活化水平。本研究发现T细胞活化时，细胞因子分泌增加，伴随着NFκB在核内的表达增加，辛伐他汀作用后抑制NFκB的转位入核，辛伐他汀剂量越大，抑制作用越强，且10 μmol/L辛伐他汀在作用24 h时的抑制作用最明显。表明抑制NFκB的转位入核可能是辛伐他汀对T细胞的抗炎作用的机制之一。其具体机制可能为：细胞在静息状态下，NFκB与其抑制因子IκB结合，形成NFκB/IκB复合体，使NFκB以无活性的形式存在于胞浆中；当细胞受前炎症细胞因子（如TNFα、IL2）等刺激后，IκB发生快速泛素化及蛋白酶解，暴露出NFκB的核定位序列，NFκB与靶基因启动子或增强子上的κB位点结合而被活化并很快转位入核，引起单核细胞趋化因子（MCP1）、TNFα、IL2等炎症因子的表达，启动靶基因的转录和蛋白合成，而辛伐他汀则对此过程有阻断作用，其具体抑制过程中的信号转导途径本研究尚未研究。
　　
　　综上所述，辛伐他汀可浓度依赖性的通过抑制NFκB的转位入核，抑制炎症细胞因子的表达分泌而抑制T淋巴细胞的炎症反应，从而达到对HF的治疗作用，改善HF患者预后。

参考文献

　　1 Ray JG，Gong Y，Sykora K，et al.Statin use and survival outcomes in elderly patients with heart failure〔J〕.Arch Intern Med，2005；165(1):627.

　　2 Gurgun C，Ildizli M，Yavuzgil O，et al.The effects of short term statin treatment on left ventricular function and inflammatory markers in patients with chronic heart failure〔J〕.Int J Cardiol，2008；123（2）:1027.

　　3 Krum H.Universe: rosuvastatin has no effect on ventricular remodeling〔S〕.Presented at the annual meeting of the American College of Cardiology，Atlanta，Georgia，2006.

　　4 Tousoulis D，Charakida M，Stefanadi E，et al.Statins in heart failure.Beyond the lipid lowering effect〔J〕.Int J Cardiel，2007；115（2）:14450.

　　5 Azuma RW，Suzuki J，Oqawa M，et al.HMGCoA reductase inhibitor attenuates experimental autoimmune myocarditis through inhibition of T cell activation〔J〕.Cardiovasc Res，2004；64(3):41220.

　　6 Yu Q，Watson RR，Marchalonis JJ，et al.A role for T lymphocytes in mediating cardiac diastolic function〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005；289(2):H64351.