胞浆型磷脂酶A2在急性心肌梗死大鼠心肌组织中的表达

　　　　 作者：李卫华 韩俊愈 孙常青 谢强 赵岩 林粼

【摘要】 目的 观察急性心肌梗死早期心肌组织胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA及蛋白表达，探讨cPLA2在心肌细胞损伤中的作用。方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组，心肌梗死组(AMI组，按时间不同分5组，每组10只)，建立大鼠急性心肌梗死模型，按照心肌梗死不同时间(0、1、2、3、6和12 h)处死动物。免疫组化检测心肌cPLA2蛋白表达情况。采用RTPCR检测心肌cPLA2mRNA表达水平。通过透射电镜观察心肌细胞超微结构的改变。结果 ①与假手术组比较，AMI组心肌cPLA2mRNA水平均出现不同程度上调，以梗死后2 h达到峰值(0.655±0.035，P<0.01)。②假手术组与AMI组cPLA2蛋白都有阳性表达，AMI组cPLA2表达增加，且以梗死后2 h最为显著(0.207±0.018，P<0.01)。③假手术组心肌组织形态及超微结构改变不明显;AMI组心肌损伤较重，缺血心肌在急性心肌缺血后12 h内，其病理学变化未见显著改变。结论 心肌梗死后心肌组织cPLA2激活导致了心肌细胞及细胞器膜完整性破坏、能量代谢及收缩功能的障碍。

【关键词】 急性心肌梗死;心肌细胞;胞浆型磷脂酶A2;超微结构

急性心肌梗死(AMI)时心脏肌钙蛋白和肌酸激酶(MB)片段(CKMB)水平升高，同时还有临床急性缺血的背景，即可诊断为心肌梗死〔1〕，但这些生化标志物仅反映心肌缺血，不能说明缺血的机制〔2，3〕。因此，探讨AMI的缺血机制及其心肌损伤的相关因子就显得尤为重要。胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)是一种与冠心病有关的新的炎症标志物，而且可能直接参与冠心病。研究〔4，5〕表明，cPLA2可能是心肌细胞在急性缺血缺氧条件下磷脂水解、释放脂性炎症介质的主要磷脂酶(PLA2)，在AMI后心肌细胞在缺血缺氧下损伤的重要原因之一。心肌缺血时膜磷脂降解加剧、脂类炎症介质增多，可能是导致细胞从可逆性损伤到不可逆性损伤的关键事件〔6〕。目前关于各型PLA2在缺血性心肌损害膜磷脂降解中的具体作用尚不十分清楚。本研究旨在探讨cPLA2激活与心肌组织损伤的的关系及其意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组及模型建立 健康雄性SD大鼠60只，体重200～220 g，上海斯莱克试验动物有限责任公司提供〔许可证号：SCXK(沪)20070005〕，SPF级。随机分成6组：假手术组，AMI 1、2、3、6、12 h组。用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)行腹腔注射麻醉，经口气管插管，接小型呼吸机，沿胸骨左缘切开第4肋间，剪开心包，暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥交点下0.1 cm结扎左冠脉前降支，以肉眼见心肌组织变白，局部心肌运动减弱，心电图出现ST段明显上抬，提示结扎成功。AMI后1、2、3、6、12 h处死动物迅速取出心脏，留取部分左心室心肌(前壁近心尖部)，进行相关指标检测。假手术组模型制备方法同上，但只穿线不结扎冠状动脉。

　　1.2 主要试剂与仪器 TrizolA+总RNA提取剂、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒、Tag Plus DNA Polymerase等均购自厦门海诺达科学仪器公司。CF15高速冷冻离心机、H600 透射电镜(Hitachi，日本)，PT2000聚合酶链反应 (PCR) 扩增仪(MJ&PE，美国)，Leica RM 2025 病理切片机(德国);Olympus BX40显微镜(日本);Motic Med 6.0数码医学图像分析系统(北京麦克奥迪仪器仪表有限公司，中国);UV200紫外分光光度计(Shimadiu，日本)，伯乐GELDOCXR电泳与凝胶成像分析系统(Bio Rad 公司，美国)。

　　1.3 RTPCR检测心肌组织cPLA2 mRNA表达 ①心肌组织总RNA提取及浓度和纯度测定：参照提取剂说明书进行操作。取新鲜100 mg心肌组织加1 ml Trizol，玻璃匀浆器中匀浆，室温放置5 min，4℃离心10 min收集上清。加0.2 ml氯仿，剧烈摇晃15 s，室温放置3 min，4℃离心15 min，转移上层无色液相(约0.5 ml)至另一聚乙烯离心管。加0.5 ml异丙醇，盖上盖子，倒转数次彻底混匀，室温孵育25 min，4℃离心10 min，弃上清。加1 ml质量分数为75%的乙醇，洗涤沉淀，样品4℃离心3 min，弃上清，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，空气中挥发管内残余乙醇至干，加入0.05 ml左右DEPC水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。测定样本在波长为260、280和320 nm下的吸光度值(A260、A280和A320)，计算RNA浓度及纯度(各样本A260/A280比值均>1.65)。②互补DNA(cDNA)合成：逆转录采用RTPCR试剂盒，根据说明书使用20 μl的混合体系(其中1 μl包含1 μg总RNA)，42℃ 50 min，95℃ 5 min，-20℃冰冻保存。③PCR扩增：目标基因cPLA2及内参照βactin反应体系，总体积均为20 μl，DEPC水7.5 μl、10×buffer 2 μl、dNTP 4 μl、Tag酶0.5 μl、cDNA 2 μl、cPLA2(或βactin)上、下游引物各1 μl，各管中加入上述反应体系，PCR扩增仪扩增。扩增条件:94℃变性5 min，94 ℃变性40 s，48℃复性40 s，72℃延伸45 s，30个循环后72℃延伸10 min。cPLA2、βactin引物序列:cPLA2:上游5′CGACGCAGCGGTAGCAGAT 3′，下游3′TGGACGGCATAGGGAACT 5′，扩增产物119 bp;βactin：上游5′TCAGGTCATCACTATCGGCAAT 3′，下游5′AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA 3′，扩增产物432 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。④电泳及条带分析:制备凝胶，扩增产物在含溴化乙锭(EB)及质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶中电泳(80 V)，电泳缓冲液为质量分数为0.5% 的Tris乙酸，将扩增产物及参照标准(Marker)各10 μl与5 μl上样buffer混匀、点样，80 mV电泳至条带跑至凝胶2/3处。紫外光下观察，凝胶图像分析系统扫描扩增产物电泳条带的密度，计算cPLA2的相对量以及cPLA2电泳条带密度/βactin电泳条带密度。

　　1.4 免疫组化检测心肌组织cPLA2蛋白表达 标本经4%多聚甲醛液固定、脱水、石蜡包埋，切成厚4 μm切片。切片经常规脱蜡和水化，高压抗原修复5 min，用PBS漂洗3次，每次5 min。一抗为兔抗大鼠cPLA2多克隆抗体(Abcam公司，英国)，二抗为快速型酶标记羊抗兔IgG(福州迈新生物技术开发公司)。滴加以1∶200的比例稀释一抗，37℃孵育1 h，用PBS漂洗3次，每次5 min，加酶标二抗孵育30 min，用PBS漂洗3次，每次5 min。加DAB显色5 min，自来水冲洗10 min，苏木精衬染、透明、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。细胞质显示棕黄色为cPLA2蛋白阳性。显微图像采集系统对每张免疫组化切片随机选取5个高倍视野(×400)，利用专业图像分析软件分析，求出平均积分光密度(AIOD)。

　　1.5 电镜观察 取备用的心肌组织，经体积分数为1%的锇酸双固定，乙醇丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸双氢铀枸橼酸铅(铀铅)染色，采用H600透射电镜下观察心肌组织的超微结构。

　　1.6 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS14.0行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 心肌组织cPLA2 mRNA表达 见图1，表1，AMI后cPLA2 mRNA的表达迅速增加。与假手术组比较，AMI后1 h cPLA2 mRNA的表达已明显增高(P<0.01)，AMI后2 h达到峰值，AMI后2～12 h cPLA2mRNA的表达呈下降趋势，AMI后12 h组与假手术组比较，仍差异显著(P<0.01)。

　　2.2 心肌组织cPLA2蛋白表达 见图2，表1，在假手术组与AMI组中，cPLA2蛋白都有阳性表达，即心肌胞浆内可见弥漫的棕黄色，并且AMI组蛋白表达区域明显多于假手术组。AMI后2 h cPLA2蛋白表达达到高峰(P<0.01)，其后下降，但均高于假手术组水平(P<0.01)。表1 cPLA2 mRNA和蛋白的表达

　　2.3 AMI后心肌组织超微结构的改变 透射电镜观察到假手术组心肌细胞组织超微结构未见明显异常改变，膜性结构完整，肌丝排列整齐，Z线清晰，线粒体结构基本正常，嵴致密。AMI后心肌组织超微结构的改变包括心肌细胞肌丝灶性溶解，Z线断裂，Z线物质堆积，形成异常收缩带;质膜下水分集聚及质膜破裂，少数膜性细胞器退变，可见髓样结构形成;线粒体代偿性增生，并伴有中到重度内室肿胀，偶见膜破裂。见图3。

　　3 讨 论

　　cPLA2正常存在于胞浆，与分泌型PLA2不同，cPLA2不能分泌至胞外，通过受体介导的信号途径，在一定Ca2+浓度下，cPLA2被磷酸化而激活，活化的cPLA2迁移至膜性结构如胞膜、核膜等，选择性水解膜磷脂分子2位的酰酯键，释放出花生四烯酸等脂性炎症介质，同时破坏膜结构的完整性〔7〕。本研究结果显示，cPLA2 mRNA及cPLA2蛋白在正常及AMI的心肌细胞中均有表达，但AMI后1 h心肌cPLA2表达较正常组显著增加，2 h达高峰，12 h内一直维持在较高水平。

　　本研究显示，AMI后心肌组织中cPLA2的基因表达水平有明显增强，蛋白表达水平也同步上调，同时通过透射电镜观察到心肌组织的超微结构改变，包括细胞膜破坏出现髓样结构，线粒体增生、肿胀、溶解，肌丝溶解断裂，提示cPLA2激活可能在心肌细胞及细胞器膜完整性破坏，能量代谢及收缩功能障碍中扮演了重要的角色，这些因素最终可引起心肌水肿、顺应性降低，心功能减退，心肌收缩力、血压及心排血量下降以及出现心律失常等。

　　最近，在脑缺血再灌注的研究中，研究人员发现cPLA2缺乏的大鼠较野生型大鼠明显抗缺血和氧化损害，也说明cPLA2在缺血、缺氧性脏器损害中具有重要作用〔8〕。蛋白酶抑制剂(如抑肽酶) 由于能够抑制纤维蛋白降解，减少炎症因子及激肽酶释放，削弱炎症反应，保护脏器功能，而在心脏外科手术中广泛应用〔9〕。虽然基础及临床对心肌缺血进行了大量的研究和有益的尝试，但目前仍缺乏十分有效的防治手段，为进一步开发及应用器官特异性cPLA2抑制剂提供理论依据，特异性cPLA2抑制剂的应用有望成为减缓急性心肌梗死后心肌细胞损伤进程强有力的武器，为溶栓和急诊经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的再灌注治疗赢得了宝贵时间，挽救更多的濒死心肌，提高患者生活质量。

参考文献

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