人骨髓间质干细胞分离、培养、分化和鉴定方法的研究

　　　　 作者：杨宏辉 蒲晓群 高传玉 李传昶 徐予 陈岩

【摘要】 目的 探讨人骨髓间质干细胞(hMSCs)分离和体外培养的适宜条件，检测其多向分化的能力。方法 应用细胞生物学干细胞培养法、分子生物学干细胞组织工程学等方法研究hMSCs的分离、培养并检测其多向分化潜能。结果 hMSCs增殖能力在一定的范围内(2.5%～20%)随着血清浓度的增加而增大，20%的血清浓度最适宜，其增殖活性在一定种植密度范围内(1～8×104/ml)随种植细胞数量增加而增高，在种植细胞密度为8×104/ml时，细胞的增殖活性最高。所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增的稳定的细胞。hMSCs在成脂培养基中有脂肪细胞形成，苏丹Ⅲ染色法将脂肪细胞胞浆染成桔红色。在成软骨培养基中有软骨细胞形成，阿尔新蓝染色法将软骨结节样结构染为深蓝色。在成骨培养基中有成骨细胞形成，Von Kossa染色法显示有黑色矿化结节形成。该细胞在特定的诱导培养条件下具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化能力，符合判定hMSCs的“金标准”。结论 所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增并保持未分化状态的、稳定的细胞，其在体外诱导条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化，是一种具有多向分化潜能的细胞。

【关键词】 间质干细胞;骨髓;多向分化

人骨髓间质干细胞(hMSCs)是一种具有高度增殖和分化能力的成体干细胞。目前己从多种动物体内分离出骨髓间质干细胞，但是尚缺乏间质干细胞特定的表面标志，各实验室分离获取间质干细胞的方法和技术也没有统一的标准〔1〕。目前临床上开展干细胞移植尚有许多困难，造血干细胞、骨髓混杂细胞，粗分离的间质干细胞局部移植均有一定疗效，但是何种干细胞起主要作用尚不清楚;在移植干细胞之前是否需要将其分化为心肌细胞及如何使之分化也不清楚〔1～3〕。本实验采用梯度离心分离后再贴壁培养的方法进行分离、培养hMSCs，然后用观察细胞分化的方法进行鉴定，给后续实验打下良好的基础。在培养的方法、分化和鉴定方面均有创新，有简单、经济、实用、有效的特点。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 胎牛血清:美国Hyclone;LDMEM培养基为美国Hyclone产品;地塞米松、胰岛素、β磷酸甘油、抗坏血酸等为Sigma公司产品。

　　1.2 hMSCs的分离 3 ml抗凝的幼儿骨髓与等体积磷酸盐缓冲液(PBS)混合，室温，2 000 r/min离心10 min，用PBS冲洗两次。重新悬浮细胞，细胞密度4×107/ml。密度梯度离心法分离细胞，将2～5 ml细胞铺在1.037/ml Percoll溶液上，2 000 r/min离心30 min，收集中间相为有核细胞。将细胞悬浮在hMSCs培养基中(低糖DMEM+15%胎牛血清培养基)，细胞密度4×106/ml。

　　1.3 hMSCs的原代及传代培养和纯化 以4×106/ml的细胞密度接种到骨髓间质干细胞培养基中，含100 IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。72 h第一次换液，此后每4天换一次培养基;细胞至90%汇合时，用0.25%胰酶/EDTA消化，传代培养。重复上述操作，进行传代扩增，依次标记为P1、P2、P3等。贴附于塑料培养瓶表面的细胞被认为是hMSCs。

　　1.4 不同浓度胎牛血清对骨髓间质干细胞生长的影响 按8×104/ml的密度将P1代细胞种入96孔培养板中，分别加入以下浓度的胎牛血清:3%、5%、8%、10%、13%、15%、18%、20%、23%、25%、30%，每个浓度种6孔。培养48 h后，加入20 μl MTT(浓度为5 mg/ml)，37℃ 避光培养4 h;尽量吸掉上清液，加入150 μl二甲基亚砜，室温振荡10 min，置酶标仪上570 nm处读取D570值，以PBS作空白对照。

　　1.5 不同种植细胞密度对骨髓间质干细胞生长的影响 按以下密度(×104/ml):3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，将P1代细胞种入96孔培养板中，每种密度种6孔。培养48 h后，加入20 μl MTT，37℃避光培养4 h，吸掉上清液，加入150 μl二甲基亚砜，室温振荡10 min，置酶标仪上570 nm处读取D570值，以PBS作空白对照。

　　1.6 骨髓间质干细胞向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞诱导分化和鉴定 培养P5代细胞培养24 h后，分别在培养体系中加入成脂培养基〔10-8mol/L地塞米松+0.25 nmol/L 3异丁基1甲基黄嘌呤(IBMX)+66 nmol/L胰岛素〕(4 d换液一次，维持22 d)，成软骨培养基(10-7mol/L地塞米松+50 ng/ml甲状腺素+20 mmol/L β磷酸甘油)(4 d换液一次，维持22 d)，成骨培养基(10-7mol/L地塞米松+10 mmol/L β磷酸甘油+50 μg/ml抗坏血酸)(4 d换液一次，维持44 d)进行向脂肪细胞，软骨细胞，成骨细胞的诱导〔3〕。每日在相差显微镜下观察细胞变化，并作相关鉴定检测:用苏丹Ⅲ染色法检测脂肪细胞，阿尔新蓝染色法检测软骨结节，Von Kossa染色法检测矿化结节。

　　1.7 统计学处理 数据以x±s表示，采用单因素方差分析和t检验、q检验，用SPSS12.0统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 hMSCs的分离、纯化、培养、传代 原代培养24 h后镜下观，发现培养液中有悬浮细胞，刚贴壁的细胞仍保持圆形。48 h后贴壁细胞体积明显增大，细胞为圆形或椭圆形。随着培养天数的增加，细胞不断分裂增殖，新生的细胞呈圆形，逐渐变为短梭形，最后变成长梭形，并向四周伸展(图1)。接种后72 h首次换液，可见贴壁细胞体积增大，呈梭形或多角形，核居中，含1～2个核仁成。1 w后成纤维样细胞迅速增多，互相融合，10～12 d时细胞可长满培养瓶底的80%～90%，悬浮细胞随换液除去。传代周期6 d。连续传5代，细胞被纯化，呈均匀有序的成纤维样细胞，胞浆充盈。

　　图1 骨髓间质干细胞(×100)

　　2.2 血清浓度对骨髓间质干细胞生长的影响 不同浓度的胎牛血清之间差异有统计学意义，5%组与10%组，10%组与20%组比较差异显著(P<0.05)。细胞增殖活性在一定的范围内(2.5%～20%)随着血清浓度的增加而增大，当血清浓度超过20%时，细胞增殖活性不再增高(图2)。

　　2.3 种植密度对骨髓间质干细胞生长的影响 不同种植密度范围的细胞增殖活性之间差异有统计学意义，3×104组与5×104组，3×104组与5×104组比较差异显著(P<0.05)。hMSCs的增殖活性在一定种植密度范围内(3×104～13×104/ml)随种植细胞数量增加而增高，在种植细胞密度为10×104/ml时，hMSC的增殖活性最高(图3)。

　　2.4 hMSCs向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞诱导分化和鉴定 在成脂培养基中维持培养12 d，细胞之间出现含大量脂滴的脂肪细胞，苏丹Ⅲ染色将脂肪细胞的胞浆染成桔红色:在成软骨培养基中维持培养20 d，出现软骨结节样结构，阿尔新蓝染色将软骨结节样结构染为深蓝色;在成骨培养基中维持培养35 d，出现明显高于周围细胞表面的骨结节样结构，Von Kossa染色法显示有黑色矿化结节形成，用中性红复染后明显可见向成骨细胞分化的黑色矿化结节，周围未分化的细胞胞浆染成红色(图4)〔4〕。

　　3 讨 论

　　骨髓间质干细胞因具有多向分化潜能被认为在细胞移植和基因治疗方面具有巨大的应用前景。建立稳定的体外细胞培养体系是进一步进行基因转染及细胞移植研究的基础。骨髓中的间质干细胞含量极少，在合适的培养体系中，细胞才可能贴壁生长，寻求合适的培养体系是研究的热点〔4〕。

　　目前骨髓间质干细胞的分离、纯化、培养比较常用的方法是壁细胞分离法〔5〕、密度梯度离心法〔6〕、流式细胞仪〔7〕和免疫磁珠分离法〔8〕。Friedenstein等人最早利用自然贴壁法获得了骨髓间质干细胞〔5〕。这种方法获得的骨髓间质干细胞混有多种成份的其他细胞，影响了骨髓间质干细胞的生长和性质的均一性。分离高纯度的骨髓间质干细胞已成为研究的关键。本研究采取了以密度为1.073 g/ml的Percoll为介质的梯度离心分离后再贴壁培养的方法。这种分离方法操作简单、快速、实用，对骨髓需求量少，对细胞活性影响小，更符合细胞生长的微环境，细胞不易分化。利用骨髓中间质干细胞贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性将它们分离开。在原代培养中虽然贴壁的细胞混杂有内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞，但是后三种细胞贴壁较骨髓间质干细胞要牢固。我们通过严格控制消化液的量和时间，让骨髓间质干细胞在短时间内脱离瓶壁，而且内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞在传代的过程中处于生长劣势，通过反复消化传代，将骨髓间质干细胞与内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞分离开，一般传至第五代骨髓间质干细胞即可被纯化，经过多次传代，得到进一步纯化的骨髓间质干细胞。

　　体外培养的细胞受培养基、培养血清的浓度和活性、种植细胞的密度、培养的温度、培养基pH值等等因素影响。本研究提示血清的浓度和活性对整个培养体系至关重要。根据文献〔9〕挑选出最利于骨髓间质干细胞生长的胎牛血清，使用浓度一般在10%～20%，本实验发现骨髓间质干细胞在浓度为20%的胎牛血清中增殖能力最强，血清浓度超过20%时，其增殖能力反而降低。可能因为高浓度血清中含有大量促进骨髓间质干细胞生长分化的因子，会使其过早分化;骨髓间质干细胞种植密度的多少对细胞的生长有很大影响。该细胞是一种对细胞密度依赖性很强的细胞，细胞密度过低时，增殖缓慢，甚至处于停滞状态，可能是由于生长的微环境中缺少适宜的生长因子所致;密度过高，会出现生长接触性抑制，也容易老化。有文献报道，骨髓间质干细胞在种植密度极低的时候也能快速扩增〔10〕。本实验中是以10×104/ml的细胞数进行种植最利于细胞生长。

　　目前，鉴定骨髓间质干细胞的方法并无统一标准，最常用的两种方法是:一种是用流式细胞仪法检测骨髓间质干细胞的表型〔5〕;还有一种就是看其能否向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化〔11〕。Pittenge研究〔11〕小组曾经对500多个标本用70多种抗体，也没有找到一种特异性的标记物，目前亦没有发现骨髓间质干细胞特异性的表面标志，而且它同时兼有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点。流式细胞仪法检测骨髓间质干细胞表型的方法属特异性不高的排除法，而且操作复杂，成本高。本实验采用第二种方法，因为Pittenger等〔11〕认为判定骨髓间质干细胞的“金标准”是:能在适宜的刺激下向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化的就是骨髓间质干细胞，这种鉴定方法简单、经济、实用、有效。

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