新生期注射谷氨酸单钠对老年雄性大鼠骨质疏松疗效的影响

【摘要】 目的 探讨新生期注射谷氨酸单钠损毁下丘脑弓状核对老年雄性大鼠骨质疏松疗效的影响。方法 选用24只新生期雄性SD大鼠，随机分成注射谷氨酸单钠对照组(MA)、注射生理盐水对照组(NA)、注射谷氨酸单钠治疗组(MT)、注射生理盐水治疗组(NT)，同等条件下饲养至700 d龄，治疗组给予甲基睾丸素和钙剂治疗120 d，处死收集血清行睾酮(T)和雌二醇(E2)放免检测，取左侧胫骨干骺端行组织形态计量学分析等。结果 与MA组比较，MT组大鼠T和E2水平明显增加，胫骨干骺端%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th明显增加，但T、E2水平升高、骨组织计量学参数的变化、骨量的改变、骨质疏松程度减轻等效果比注射生理盐水组大鼠差。结论 弓状核参与了老年雄性大鼠骨质疏松治疗过程的调控，进一步证实了下丘脑弓状核参与骨质疏松形成的调控。

【关键词】 左旋谷氨酸单钠;下丘脑弓状核;骨代谢;骨质疏松

近年来国内外研究发现，瘦素通过中枢神经系统可以调控骨形成，其作用部位很可能在下丘脑〔1〕。已有文献报道，新生期大鼠注射左旋谷氨酸单钠(MSG)可选择性损毁下丘脑弓状核(ARC)神经元〔2，3〕。笔者曾经报道新生期注射MSG可导致大鼠骨质疏松〔4〕，下丘脑弓状核通过下丘脑生长激素胰岛素样生长因子I轴和下丘脑垂体性腺轴调控骨代谢和骨的生长发育〔5，6〕。本研究通过观察新生期注射MSG损毁下丘脑弓状核对老年雄性大鼠骨质疏松疗效的影响，进一步探讨ARC对骨代谢的调控，同时为男性骨质疏松的防治提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 选用体重为5.5～6.5 g的新生期雄性SD大鼠(广东医学院实验动物中心提供)，采用同窝对照的方法，按体重随机分为新生期注射MSG对照组(MA)、新生期注射生理盐水对照组(NA)、注射MSG治疗组(MT)、注射生理盐水治疗组(NT)，每组6只，并用龙胆紫作好标记。注射MSG组大鼠在出生后第1、3、5、7、9天颈部皮下注射10% MSG(上海化学试剂公司，4 g/kg体重)共5次;注射生理盐水组同法皮下注射等体积的生理盐水。

　　1.2 动物饲养及处理 24 d断奶，在完全相同的条件下饲养至700 d龄时，MA组与NA组大鼠给予生理盐水，按每天0.6 ml/100 g灌胃，MT组和NT组大鼠每天给予甲基睾丸素(12 μg/100 g)和碳酸钙(0.833 g/100 g)，所有药物均配成混悬液，按每天0.6 ml/100 g灌胃，120 d后处死取材，取血清、脑、右侧胫骨，放入10%的福尔马林液中固定。

　　1.3 检测指标及方法 取下丘脑作石蜡冠状切片，厚度为4 μm，HE染色后光镜下(40×10)观察，在弓状核正中隆起层面圈定同一范围，利用LEICA Qwin图像分析软件计算ARC神经细胞数。采用放免分析法测定血清雌二醇(E2)、睾酮(T)的水平(放免试剂盒购自天津九鼎医学生物工程公司)。取右侧胫骨上1/3段经脱钙、脱水、透明、石蜡包埋，矢状面连续切片，厚度为5 μm，行胶原纤维特殊染色后采用半自动图像数字化分析仪测定骨小梁面积、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁分离度，将上1/3段胫骨的HE染色片在高倍视野下(40×10)进行破骨细胞记数。

　　1.4 统计学处理 测量数据使用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，先行方差齐性检验，方差齐者使用t检验，方差不齐的经变量转换后使用t检验或直接使用非参数检验。

　　2 结 果

　　2.1 老年大鼠ARC细胞计数 NA组50.2±6.5，MA组13.0±2.0，MT组13.2±3.7，NT组53.2±6.5。与NA组比较，MA组大鼠ARC区域内神经细胞数明显减少，差异有非常显著性意义(P<0.01)，损毁程度达70%～80%，见图1。

　　2.2 老年大鼠胫骨干骺端松质骨的变化 见表1，MA组大鼠胫骨干骺端松质骨的%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th显著低于NA组(P<0.01，P<0.05)，而Tb.Sp显著高于NA组(P<0.05)。治疗后MT组大鼠的%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th显著高于MA组(P<0.05)，而Tb.Sp显著低于MA组(P<0.05)。光镜下观察见图2，与MA组比较，MT组大鼠骨小梁数量增加、明显变厚。治疗后NT组大鼠的%Tb.Ar、Tb.Th显著高于NA组(P<0.05)，而Tb.Sp显著低于NA组(P<0.05)。

　　2.3 老年雄性大鼠血清中性激素水平的改变 见表1。MA组大鼠血清中T、E2的水平明显低于NA组(P<0.05)。治疗后MT组大鼠血清中T、E2的水平明显升高，与MA组相比，差异有显著性意义(P<0.05)。治疗后NT组大鼠血清中T、E2的水平明显升高，与NA组相比，差异有显著性意义(P<0.05)。表1 治疗前后各组大鼠胫骨干骺端骨组织形态计量学参数及性激素水平的比较

　　3 讨 论

　　MSG是一种神经毒素，能选择性地破坏新生期大鼠、小鼠等动物下丘脑弓状核神经胞体，而对路过或终止于弓状核的神经纤维无明显影响。许多研究表明，通过外周给予新生大鼠MSG可作为损毁下丘脑弓状核的动物模型〔7，8〕。

　　近年来研究发现，衰老时弓状核内神经元的数量和形态均发生显著变化。Mille等发现老年小鼠(18～20月龄)弓状核内神经元的数量减少了31%，核周体的总面积减少10%，而细胞核的总面积却增加。Sartin等〔9〕研究了衰老时大鼠下丘脑神经元数量的变化，发现弓状核内神经元的数量减少最明显。弓状核神经元的老化同生殖系统的衰老有密切的联系。许多研究表明，弓状核在下丘脑垂体性腺轴中起重要的作用，被认为是调节性激素分泌的基本中枢，同时又是性腺分泌激素反馈调节的直接靶器官，老年下丘脑弓状核神经元发生衰老性改变，进而影响到神经元内各种神经递质合成分泌活动的降低，从而引起衰老过程中神经内分泌功能的紊乱。

　　MSG兴奋性毒性作用机制可能与下面几方面有关。MSG作用于细胞膜上的α氨基3羟基5甲基4异唑丙酸盐(AMPA)、海人藻酸(KA)受体，使Na+通透性增加，Na+大量内流，使膜电位发生变化，使Cl-顺电位差大量内流，水大量内流引起神经元急性肿胀。MSG作用于细胞膜上N甲基D天冬氨酸(NMDA)受体，使Ca2+通透性增加，Ca2+大量内流，并通过亲代谢受体导致细胞内三磷酸肌醇生成量增多，后者刺激内质网Ca2+释放，激活磷酸酶及蛋白酶，使细胞受损害，引起一系列生化反应，最终导致迟发性神经元坏死〔10，11〕。

　　本研究表明，新生期注射MSG诱导的老年大鼠弓状核神经元数量明显减少，损毁率达70%～80%，这与吕永利和吴开云等报道的结果基本一致，而对紧邻弓状核的下丘脑内侧基底部其他核团未见明显损伤，这与报道结果相一致〔2，3〕。说明本实验损毁ARC的实验动物模型是成功的，适用于研究弓状核的功能及其对骨代谢的调控。

　　注射MSG对照组大鼠的骨小梁面积、骨小梁厚度和骨小梁数量不同程度下降，血清T、E2水平显著降低。提示新生期注射MSG损毁弓状核后，下丘脑垂体性腺功能下降，性激素水平降低，骨转化增加，导致骨质疏松的发生。给予甲基睾丸素、碳酸钙治疗120 d后，可比较全面恢复骨量及性激素水平。与MA组比较，MT组大鼠的骨小梁面积增加了26.72%，骨小梁数量增加了16.47%，骨小梁厚度增加了19.72%，而骨小梁分离度减少了17.86%;与NA组比较，NT组大鼠的骨小梁面积增加了30.63%，骨小梁数量增加了11.32%，骨小梁厚度增加了24.93%，而骨小梁分离度减少了11.03%。与MA组比较，MT组大鼠的T水平增加了64.9%，E2水平增加了36.5%;与NA组比较，NT组大鼠的T水平增加了120.1%，E2水平增加了27.3%。

　　本研究还表明，新生期注射MSG组大鼠损毁弓状核后，用同样的治疗，T、E2水平升高、骨组织计量学参数的变化、骨量的改变、骨质疏松程度的减轻等效果都较新生期注射NS组差，表明药物进入体内启动与骨代谢相关因素的过程需要弓状核的参与。也就是说，ARC神经细胞的显著减少可降低疗效，提示T、E2等在体内影响骨代谢、抗骨质疏松的过程中，需要弓状核的参与，此结果与Elefteriou的研究结果基本一致〔8〕。

参考文献

　　1 Burguera B，Hofbauer LC，Thomas J，et al.Leptin reduces ovariectomy induced bone loss in rats〔J〕.Endocrinology，2001;142(8)：354653.

　　2 吕永利，赵书芬，李 集，等.谷氨酸单钠对新生期大鼠下丘脑内侧基底部神经元的神经毒性作用〔J〕.中国医科大学学报，1992;21：2479.

　　3 吴开云，李耀斌.谷氨酸单钠对新生期大鼠弓状核神经元损毁的实验研究〔J〕.解剖学杂志，1999;22：2735.

　　4 刘浩宇，刘锡仪.新生期大鼠注射谷氨酸单钠后导致骨质疏松〔J〕.中国骨质疏松杂志，2000;6：102.

　　5 刘锡仪，刘浩宇.新生期注射谷氨酸单钠对大鼠骨骼的影响〔J〕.中国应用生理学杂志，2006;22(3)：3636.

　　6 刘锡仪，刘浩宇.损毁弓状核对大鼠骨组织形态计量学的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2007;23(4)：7258.

　　7 SanchisSegura C，Aragon CM.Consequences of monosodium glutamate or goldthioglucose arcuate nucleus lesions on ethanolinduced locomotion〔J〕. Drug Alcohol Depend，2002;68:18994.

　　8 Elefteriou F，Takeda S，Liu XY，et al.Monosodium glutamatesensitive hypothalamic neurons contribute to the control of bone mass〔J〕. Endocrinology，2003;144:38427.

　　9 Sartin JL，Lamperti AA.Neuron numbers in hypothalamic nuclei of young，middleaged and aged male rats〔J〕.Experientia，1985;41:10911.

　　10 Hsu C，Hsieh YL，Yang RC，et al.Blockage of NmethylDaspartate receptors enhances postnatal neuronal apoptosis in rats〔J〕. Neuroendocrinology，2000;71(5):3017.

　　11 Shen W，Slaughter MM.Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina〔J〕.Neuroscience，2002;22(6):216571.