葛根素对去卵巢大鼠机体骨代谢影响的观察

　　　　作者：黄彤 金邦荃 孙桂菊 杜先锋 宛晓春

【摘要】 目的 观察葛根素对去卵巢大鼠机体骨代谢的影响，探讨其对雌激素缺乏引起的骨质疏松症的治疗作用。方法 3月龄清洁级SD大鼠60只，背驮式切除双侧卵巢后每日灌胃葛根素5 mg/kg(P5组)，10 mg/kg(P10组)和20 mg/kg(P20组)，并设假手术组(Sham)，模型组(OVX)和己烯雌酚阳性对照组(E)。3个月后处死动物，测定大鼠胫骨干重、灰分重量和矿物质含量，胫骨Ca、P含量以及血清相关骨代谢指标。结果 与OVX组相比，葛根素各组的胫骨矿物质含量(mg/g)均有增加(574±17，590±22和597±18)，其中P20组差异显著(P<0.05);葛根素各组的胫骨Ca含量(mg/g)高于OVX组 (132±10，222±7，228±8)，其中P10，P20两组差异显著(P<0.05，P<0.01)，说明服用葛根素后大鼠骨量得到增加;同时，葛根素各组的碱性磷酸酶(U/L)与OVX组有所降低(101±26，90±20，71±15)，其中P10，P20两组差异显著(P<0.05，P<0.01)，说明去卵巢大鼠骨的高转换状态得到改善。结论 葛根素能抑制去卵巢大鼠骨量的丢失，对骨代谢有较好的调节作用，对雌激素缺乏引起的骨质疏松症有一定的治疗作用。

【关键词】 葛根素;去卵巢大鼠;骨代谢

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of puerarin on the bone metabolism in ovariectomized rats， and to explore the therapeutic effect of puerarin on osteoporosis caused by the deficiency estrogen. Methods Sixty female SD rats， threemonthold， were ovariectomized bilateraliy under anesthesia.Except for the sham and OVX groups， the other animals were administrated with puerarin 5， 10， 20 mg/kg or diethylstilbestrol (100 μg/kg) respectively for 3 months. The dry weight and ash weight of tibia， tibial BMC， the contents of inorganic elements in tibia were detected as well as biochemical indexes of bone metabolism.Results Compared with that of OVX group， the tibial BMC in P20 group 〔(597±18) mg/g〕 was increased obviously(P<0.05)， the contents of Ca in tibia in P10 〔(222±7) mg/g〕 and P20 〔(228±8) mg/g〕 groups were greater than those in OVX group (P<0.05，P<0.01)， which meaned puerarin could enchance the bone mass. At the same time， the ALP activity in serum in P10 〔(90±20) U/L〕 and P20 〔(71±15) U/L〕 groups were decreased significantly comparing to those in OVX group(P<0.05，P<0.01). Puerarin could inhibit the high transition situation of bone metabolism induced by estrogen deficiency. Conclusions Puerarin can inhibit the loss of bone and has adjustive effects on the bone metabolism in ovariectomized rats， so it may have some therapeutic effects on osteoporosis caused by the deficiency estrogen.

　　【Key words】 Puerarin; Ovariectomized rats;Bone metabolism

　　 一般认为，妇女进入更年期后由于卵巢功能减退，雌激素分泌降低，影响钙代谢，钙过多的从骨骼中游离出来，最终导致骨量丢失而形成骨质疏松〔1～3〕。因此雌激素替代疗法曾经是预防和治疗绝经后骨质疏松(OP)的首选方法，但由于雌激素有一定的副作用〔4，5〕，使雌激素替代治疗疗法具有争议。葛根素是异黄酮类化合物，具有与雌激素相似的化学结构〔6〕，属于植物雌激素，具有一定的雌激素活性〔7〕。本实验采用国内外公认的雌性大鼠去卵巢建立OP模型，观察葛根素对去卵巢大鼠骨代谢的影响，旨在开发新的治疗OP的药物。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与仪器 3月龄清洁级(Sprague Dawley，SD)雌性大鼠60只，体重240～310 g。由中国科学院上海实验动物中心提供。葛根素(Puerarin)本实验室自提纯化，高效液相色谱法测定含葛根素89.69%。己烯雌酚(Diethylstilbestrol)片剂，0.5 mg/片，合肥九联制药有限公司生产。饲料：参照AIN93饲料配方配制半成品饲料，用菜粕替换饲料中的大豆饼，以避免大豆异黄酮等植物雌激素对实验结果的干扰。见表1。仪器：Avanta型原子吸收分光光度计：澳大利亚GBC公司;Olympuls AU640型全自动生化分析仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组及给药 60只大鼠，其中50只腹腔注射0.8%戊巴比妥钠(0.5 ml/100 g)麻醉后，采用背驮式切除双侧卵巢，余10只做相同的手术操作，但不切除卵巢，作为假手术组(Sham)。将切除卵巢的大鼠分为5组：去卵巢组(OVX)，己烯雌酚组(E，每天灌胃己烯雌酚100 μg/kg)，葛根素5 mg/kg组(P5)，10 mg/kg组(P10)，20 mg/kg组(P20)。除OVX组和Sham组外，各组大鼠每日灌胃己烯雌酚或葛根素。每周秤测体重一次，以调整灌胃剂量。3个月后股动脉放血处死大鼠，收集血清和骨骼样品。

　　1.2.2 血清生化指标的测定 采用Olympuls全自动生化分析仪测定血清钙(Ca)、磷(P)含量及血清碱性磷酸酶(ALP)活性。

　　1.2.3 胫骨干重、灰重及骨矿含量(BMC)的测定 取大鼠右侧胫骨，烘至恒重，记录干骨重量。将烘干的胫骨在电炉上炭化至无烟后，置于550℃马福炉中6～8 hs灰化，称量灰重，胫骨灰重与骨干重之比为骨矿含量(mg/g)。

　　1.2.4 胫骨钙磷含量测定 精确称取上述所得胫骨灰分0.1 g，1∶1盐酸溶解后用双蒸水定容至50 ml，再取1 ml于100 ml容量瓶中，双蒸水定容后即为待测溶液。

　　钙含量测定采用Avanta型原子吸收分光光度计，磷含量测定采用无机磷液体试剂盒上Olympuls全自动生化分析仪。

　　1.3 统计学处理 所有实验数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行方差分析和差异显著性检验。

　　2 结 果

　　2.1 葛根素对去卵巢大鼠血清生化指标的影响 去卵巢后，OVX组大鼠血清钙磷浓度比Sham组降低，差异不显著;ALP活性增加了151.1%，差异极显著(P<0.01)。见表2。表1 实验日粮组成及营养水平表2 葛根素对去卵巢大鼠血清钙磷含量及碱性磷酸酶活性的影与OVX组相比：1)P<0.05，2)P<0.01;与Sham组相比：3)P<0.05，4)P<0.01;下表同

　　2.2 葛根素对去卵巢大鼠胫骨Ca、P含量的影响 切除卵巢后，大鼠的胫骨钙含量显著下降了46.5%(P<0.01);磷含量变化差异不显著。见表3。

　　2.3 葛根素对去卵巢大鼠胫骨干重、灰重及矿物质含量的影响 切除卵巢后，OVX组大鼠胫骨干重降低，灰重增加，但差异不显著;胫骨矿物质含量显著下降(P<0.01)。见表4。

　　2.4 葛根素对去卵巢大鼠体重的影响 实验前，各组大鼠的体重没有显著差异。经过3个月的喂养后，各组大鼠体重均随时间增长。OVX组、葛根素各处理组体重的增长显著大于Sham组(P<0.01)。葛根素各处理组大鼠的体重增长与OVX组相比都没有显著差异。E组大鼠的体重显著低于Sham组和OVX组。见表5。表3 葛根素对去卵巢大鼠胫骨钙、磷含量的影响表4 葛根素对去卵巢大鼠胫骨干重、灰重及矿物质含量的影响表5 葛根素对去卵巢大鼠体重的影响

　　3 讨 论

　　大量资料表明，主要的食物异黄酮—大豆异黄酮对OP有较好的预防和治疗效果〔8～11〕，葛根中总异黄酮含量可达8%～10%，是大豆的几十倍甚至上百倍，而且提取纯化十分方便〔12〕。Ca，P为骨骼中主要的无机元素，是骨基质的基本原料。骨中Ca维持着骨骼的强度。Ca流失过多，骨的显微结构发生改变，则骨强度减弱。Ca代谢受多种因素影响，其中之一就是雌激素的水平。雌激素作用于成骨细胞，拮抗了糖皮质激素对成骨细胞生长的抑制，阻滞了Ca过多的从骨骼中游离出来〔2〕。本实验中，大鼠去卵巢后，Ca含量显著降低，提示去卵巢能影响钙代谢，使骨骼中钙流失过多。服用己烯雌酚和葛根素3个月后，钙含量显著增加，提示钙代谢得到了改善。

　　测定骨代谢生化指标可以直接了解骨骼的生理代谢变化。一般说来，更年期OP表现为骨形成和骨吸收的生化指标都增高。另外，通过测定骨代谢生化指标可以有效评价药物对骨代谢的影响和对OP的治疗效果，能使骨吸收指标得到控制或骨形成指标增加的药物可以防止骨质的进一步流失从而治疗OP。

　　血清ALP是最常见的评价骨形成和骨转换的生化指标，血清ALP的活性可以反映骨形成的活跃程度。血清中约50%的ALP来源于骨，50%来源于肝，极少数来源于小肠和胎盘。在绝经后10年内血清中骨ALP的含量可高达77%。更年期OP是高转换型OP，即表现为骨形成和骨吸收的生化指标都增高。本实验中卵巢摘除3个月后骨量丢失和ALP活性明显升高，即表现出典型的OP症状并伴有骨转换的增加，这与相关文献报道的结果相似〔13〕。一般认为这种ALP活性的升高是伴随着骨吸收亢进而出现的代偿性骨形成增加引起的。服用葛根素或己烯雌酚3个月后，与OVX组相比较，ALP活性都得到了有效的控制，可以推测己烯雌酚和葛根素可以抑制ALP活性升高的趋势，高转换状态得到了改善，说明葛根素对骨吸收具有抑制作用。

　　因此，葛根素能抑制去卵巢大鼠骨的高转换状态，增加大鼠的胫骨矿物质量和无机元素含量，提示葛根素能有效改善骨代谢，对去卵巢大鼠OP有较好的防治作用，是一种很有前景的防治OP的天然药物。

参考文献

　　1 Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis，Technical Report of a WHO Study Group〔J〕.World Health Drgan Tech Rep Ser，1994;843:1129.

　　2 金邦荃.植物异黄酮与骨质疏松的预防〔J〕.卫生研究，2002;31(suppl)：947.

　　3 宋丹凤，张玉梅.植物雌激素对绝经后骨质疏松的防治作用〔J〕.解放军预防医学杂志，2001;19(4)：3079.

　　4 Li CI，Malone KE，Porter PL，et al.Relationship between long durations and different regimens of hormone therapy and risk of breast cancer〔J〕. JAMA，2003;289(24):325463.

　　5 Baber RJ，O′Hara JL，Boyle FM.Hormone replacement therapy:to use or not to use〔J〕? Med J Aust，2003;178(12):6303.

　　6 韩祖斌，林 华，邓思清，等.异黄酮类植物雌激素依扑拉芬对骨代谢的作用〔J〕.中国骨质疏松杂志，1999;5(3)：4751.

　　7 郑高利，张信岳，郑经伟，等.葛根素和葛根总异黄酮的雌激素样活性〔J〕.中药材，2002;25(8)：5668.

　　8 史琳娜，苏宜香.大豆预防骨质疏松的实验研究〔J〕.食品科学，1999;20(7)：425.

　　9 Ramsey LA，Ross BS.Phytoestrogens and the management of menopausa〔J〕.Adv Nurse Pract，1999;7(5):2630.

　　10 Ho SC，Chan SG，Yi Q.Soy intake and the maintenance of peak bone mass in Hong Kong Chinese women〔J〕.J Bone Miner Res，2001;16(7):13639.

　　11 Potter SM，Baum JA，Teng H，et al.Soy protein and isoflavones:their effects on blood lipids and bone density in postmenopausal women〔J〕. Am J Clin Nutr，1998;68(6a):13759.

　　12 郑高利，张信岳，方晓林，等.葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨矿密度和骨强度的影响〔J〕.中草药，2001;32(5)：4225.

　　13 章明放，张乃鑫，谭郁彬，等.对雌性大鼠切除卵巢后骨质疏松症防治的探讨〔J〕.中华老年医学杂志，1997;16(4)：2369.