多重脑震荡对大鼠认知行为及多巴胺能神经元的影响

　　　　 作者：徐刚 江乐盛 于建云 李娟娟 吴春云

【摘要】 目的 探讨多重脑震荡(MCC) 大鼠认知行为及多巴胺(DA)能神经元的变化。方法 用金属单摆打击装置复制MCC大鼠模型，动物随机分为对照组和伤后1～24 d6个损伤组;应用Morris水迷宫实验，评价大鼠学习记忆功能，用免疫组化结合图像分析方法，研究伤后中脑黑质致密区(SNC)、腹侧被盖区(VTA)DA能神经元变化，并在光镜下对酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞进行计数。结果 在水迷宫测试中，伤后16 d组大鼠逃避寻找平台的时间明显延长;在无平台探测实验中，伤后8、16 d组大鼠在原有平台第三象限停留时间明显减少。在免疫组化实验中，SNC DA能神经元表达在伤后4、8 d组明显升高;VTA在2、4、8、16 d组明显升高(P<0.05)。结论 多重脑震荡大鼠出现较为严重的认知行为障碍;伤后大鼠SNC、VTA DA能神经元表达出现不同程度的增高。

【关键词】 多重脑震荡;Morris水迷宫;多巴胺;大鼠

脑震荡的发生率高、后遗症多〔1，2〕。目前，国内、外对单纯脑震荡动物的认知行为研究较多，但对运动医学界常见的多重脑震荡及与之相关的认知行为的实验研究尚缺乏报道。曾有学者采用液压冲击复制多次脑损伤模型〔3，4〕，但该方法要求动物处于麻醉状态而非清醒状态，不能确切地用来研究运动相关脑震荡的损伤特征和损伤机制。本研究通过复制多重脑震荡大鼠模型，应用Morris水迷宫测试，采用免疫组化方法对伤后中枢DA能神经元的病理变化进行分析，从而评价大鼠多重脑震荡后的空间学习记忆功能，探讨多重脑震荡对大鼠认知行为的影响。

　　1 动物与方法

　　1.1 动物 健康StraguDawley(SD)成年大鼠56只(由昆明医学院实验动物中心提供)，雄性，体重为(295±15)g。分笼喂养，自由进食饮水，12 h昼夜日光轮转。

　　1.2 方法

　　1.2.1 多重脑震荡大鼠模型的建立及标准控制 完全清醒的SD大鼠固定在自制铁质单摆式脑损伤复制仪上，摆锤上举使初始角达100～110°摆锤自由下落，撞击在大鼠顶枕部，复制具有一过性脑功能障碍的脑震荡大鼠。打击后，观察大鼠恢复自主呼吸的时间及各种反射情况，并严格参照单纯脑震荡判断标准〔5〕，每天同一时间复制大鼠单纯脑震荡一次，连续三天重复上述操作而获得多重脑震荡模型。

　　1.2.2 分组 将48只MCC大鼠按随机数据表分组，分为伤后1、2、4、8、16、24 d组，共6个损伤组(每组n=8)。同时设一正常对照组(n=8)。

　　1.2.3 大鼠Morris水迷宫测试 对多重脑震荡组大鼠于伤后第1～21天连续进行Morris水迷宫测试，包括水下平台、水上平台试验及无平台探测实验，具体方案参见于建云等〔5〕的方法。

　　1.2.4 免疫组化及图像分析 将制备好的大鼠脑组织冰冻切片进行抗TH、抗DBH抗体的免疫组织化学染色。应用HPIAS1000高清晰图文分析系统分别测量上述脑区内DA能神经细胞的平均灰度值，并对阳性细胞进行计数。所测物质的实际浓度与其灰度值成反比，灰度值下调，说明其实际浓度上调。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件对数据进行处理，所有结果用x±s表示，并采用单因素方差分析方法进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 Morris水迷宫测试结果 在逃避潜伏期实验中，伤后8 d组(即伤后第1～7天)和24 d组(即伤后第15～21天)大鼠Morris水迷宫测试时间延长不明显(P>0.05，见表1)。伤后16 d组(即伤后第8～14天)大鼠在水迷宫测试中逃避寻找平台的时间明显延长，尤其在16 d组的隐匿平台逃避潜伏期的第9、10天和可视平台逃避潜伏期的第13、14天更为显著(P<0.05，见表1)。

　　在无平台探测实验中，伤后8、16 d组大鼠在原有平台第三象限停留时间明显减少(P<0.05)，也即在第7天和第14天的无平台探测实验中，大鼠对空间记忆的保持情况有明显影响;伤后24 d组大鼠在原有平台第三象限停留时间稍减少(P>0.05，见表2)。表1 各组动物隐匿平台逃避潜伏期、可视平台逃避潜伏期变化　表2 对照组与MCC后各组无平台探测实验中各象限时间变化与对照组比较：1) P<0.05

　　2.2 伤后不同时间点相关脑区DA能神经细胞计数结果 在SNC DA能神经纤维内酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数以伤后1 d开始升高，8 d达到高峰，与对照组相比4、8 d组有显著性差异(P<0.05);与对照组相比，VTA 2、4、8、16 d组有显著性差异(P<0.05)，4 d组TH阳性细胞数达到高峰，24 d组基本恢复(见表3)。

　　2.3 伤后不同时间点相关脑区DA能神经细胞表达结果 在SNC以伤后1 d开始升高，4、8 d组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，24天组基本恢复。与对照组相比，VTA 2、4、8、16 d组有显著性差异(P<0.05)，2 d组阳性反应最强(P<0.01)，24 d组基本恢复(见表4)。表3 各组中脑SNC、VTA DA能神经细胞数的变化与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05表4 各组中脑SNC、VTA DA能神经细胞灰度值的变化与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

　　3 讨 论

　　3.1 MCC后不同时间点的认知行为学测试及意义 Morris 水迷宫是英国心理学家Richard GM.Morris 1981年发明并应用于学习记忆脑机制研究的，此模型被广泛应用于啮齿类动物的学习记忆研究中。实验时，大鼠在特定的水池中，出于求生的本能寻找一立足地。在水面下一固定位置有一个隐藏的平台，大鼠只有找到平台才能获救。在这样一个逃避性学习过程中，如果大鼠找到水下平台的时间越长，说明其空间记忆能力越差;大鼠经水下和水上平台学习强化后，在探测性试验中去掉平台，如果大鼠有良好的空间学习记忆能力，就会在原平台所在区域停留较长的时间。本实验中，MCC后8～14 d大鼠逃避寻找平台的时间明显延长，尤其在MCC后水下隐匿平台测试的第9、10天和水上可视平台的第13、14天，与对照组相比，差异具有显著性，提示MCC大鼠学习记忆功能受损严重。在8 d组的无平台探测试验中(即第7天)和 16 d组的无平台探测试验中(即第14天)，在原有平台象限(第Ⅲ象限)停留时间与对照组相比明显减少，差异具有显著性，提示MCC大鼠对空间记忆的保持情况有严重的影响。因此，水迷宫测试结果表明，MCC后大鼠出现中期(伤后7～14 d)学习记忆功能障碍，而对早期(伤后1～6 d)无明显影响。以上Morris水迷宫测试提示，MCC后大鼠出现中期(伤后7～14 d)学习记忆功能障碍，而对早期(伤后1～6 d)无明显影响。MCC大鼠在Morris 水迷宫实验中，表现为伤后较长时间的空间认知行为障碍，可以推测这与其多次受损导致损伤累积作用有关。

　　3.2 MCC后不同时间点相关区DA能神经元的变化及意义 文献资料显示，创伤性脑损伤对TH表达具有一定的影响。Yan等〔6，7〕运用控制性皮层冲击造成TBI模型，用免疫组化和免疫印迹法检测伤后28 d后TH表达情况，免疫组化结果显示纹状体的TH表达升高，免疫印迹结果显示前额叶皮质的TH表达明显升高。吴春云等〔8〕运用金属单摆式打击装置复制脑震荡大鼠模型，应用免疫组化方法检测前额叶皮质的DA能神经纤维。发现伤后TH阳性纤维的密度增加、反应增强，伤后4 d达到高峰，之后逐渐下降，直至伤后24 d仍显著增高。

　　本研究显示，MCC后脑SNC TH阳性反应以伤后1 d开始升高，8 d达到高峰，与对照组相比4、8 d组有显著性差异;而VTA 2、4、8、16 d组有显著性差异，以4 d组TH阳性反应达到高峰，24 d组基本恢复。本实验中MCC后阳性产物表达急剧升高，可能与MCC后神经元的应激反应有关。文献资料表明〔9〕，脑损伤时作用于神经系统的瞬间机械暴力达到一定程度，导致广泛的神经元过度兴奋，造成Ca2+处于超载状态。在ATP、Mg2+存在下，神经元内TH活性可被Ca2+激活而提高2～3倍，TH大量活化加速了DA能神经元合成DA，造成DA大量堆积。而TH应激性增高之后出现表达持续增高，可能是DA神经元上调其合成能力的一种代偿反应。VTA区的TH阳性反应较SNC发生早且持续时间长可能与两者在脑内分布部位有关，VTA较SNC更靠近应力的主传导途径因而损伤严重、TH阳性反应更趋明显。

参考文献

　　1 Weber J，Jaksche H.Craniocerebral trauma in sport with recommendations for prevention〔J〕. Sportverletzung Sportschaden，1999;13(1):305.

　　2 Ravdin LD，Barr WB， Jordan B，et al.Assessment of cognitive recovery following sports related head trauma in boxers〔J〕.Clin J Sport Med，2003;13(1):217.

　　3 de Ross AL，Adams JE，Vane DW，et al.Multiple head injuries in rats:effects on behavior〔J〕.J trauma，2002;52(4):70814.

　　4 Elmut H，Aurer L.Mild head injury increasing the brain′s vulnerability to a second concussive impact〔J〕.J Neurosurg，2001;95(5):85970.

　　5 于建云， 林海英， 吴春云，等.大鼠脑震荡后8天不同损伤程度空间认知行为的变化〔J〕.昆明医学院学报，2005;26(4):13.

　　6 Yan HQ，Kline AE，Ma X，et al.Tyrosine hydroxylase，but not dopaminebetahydroxylase，is increased in rat frontal cortex after traumatic brain injury〔J〕.Neuroreport，2001;12(11):23237.

　　7 Yan HQ，Ma X，Chen X，et al.Delayed increase of tyrosine hydroxylase expression in rat nigrostriatal system after traumatic brain injury〔J〕.Brain Res，2007;1134(1):1719.

　　8 吴春云，于建云，林海英，等.脑震荡对大鼠多巴胺能神经元及神经纤维的影响〔J〕.解剖学杂志，2006;29(1)：725.

　　9 郭 京.脑损伤研究进展〔M〕.见：赵雅度主编.神经病学.第11卷.北京：人民军医出版社，2001：14460