PDS对二次打击大鼠RAS系统相关基因的影响

【摘要】 目的 探讨二次打击时肾素血管紧张素醛固酮系统(RAS)相关基因的变化和应用人参二醇组皂苷(PDS)后对相关基因的影响。方法 利用失血性休克对Wistar大鼠进行首次打击，给予PDS预治疗;应用脂多糖(LPS)腹腔注入的方式进行二次打击，6 h后处死动物，留取肺脏组织和血清，检测大鼠肺脏组织中血管紧张素转换酶(ACE)、血管紧张素原(AGT)、血管紧张素(Ang)Ⅱ受体1和2(AT1和 AT2)的表达，放免法检测大鼠血清AngⅠ、AngⅡ的变化和应用PDS后对以上各指标的影响。结果 二次打击大鼠模型肺脏组织ACE、AGT表达水平明显高于对照组(P<0.01)，应用PDS后ACE、AGT表达水平较二次打击模型组明显降低(P<0.05)。免疫组化染色结果显示二次打击模型组大鼠肺组织中ACE蛋白和AngII蛋白呈强阳性表达;应用PDS后大鼠肺组织中ACE蛋白和AngⅡ蛋白呈弱阳性表达。放免法检测结果显示：二次打击6 h后血清中AngⅡ含量明显高于对照组(P<0.05);应用PDS后AngⅡ含量明显低于二次打击模型组(P<0.01);而AngⅠ变化不明显。结论 二次打击可激活RAS，通过增加ACE、AGT表达，促进AngⅡ生成增加，加重肺损伤。而应用PDS可降低ACE和AGT的表达，减少AngⅡ生成，减轻肺损伤。

【关键词】 急性肺损伤;二次打击;内毒素;人参二醇组皂苷;肾素血管紧张素醛固酮系统

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种致病因素(创伤、休克、感染、烧伤等)导致的急性进行性呼吸衰竭，其发病机制尚未完全阐明，现在较为公认的是“二次打击”(twohit)学说。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素血管紧张素醛固酮系统(RAS)的主要活性物质，其生物学功能主要体现在调节血管张力、血流及促进细胞生长、增生等方面。近年来研究发现，AngⅡ还具有另一重要功能——致炎作用。它可调节细胞因子、化学趋化因子和黏附分子等多种炎症介质的表达，参与机体炎症相关疾病的发生和发展，也可能是造成ALI的重要因素。本实验以失血性休克作为第一次打击，给予人参二醇组皂苷(PDS)预治疗;应用脂多糖(LPS)腹腔注入的方式进行二次打击，模拟临床上难治性休克引起ALI的病理过程，观察二次打击时RAS系统相关基因的变化和应用PDS后对相关基因的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 PDS(由吉林大学天然药物研究室提供);Trizol Reagent(购自Invitrogen公司);dNTP、MMLV逆转录酶、oligo(dT)、Taq DNA合成酶(购自Promega公司);琼脂糖(购自Sigma公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)、DGL2000 DNA Marker;其他常规化学试剂均为进口或国产分析纯产品。

　　1.2 实验动物及分组 30只成龄Wistar大鼠，由吉林大学医学动物繁育中心提供。雌雄不拘，体重230～250 g。参照体重随机分为：(1)假手术组(S组)：只分离颈总动脉、股动脉、股静脉并插管，但不放血;(2)二次打击模型组(HL组)：即失血性休克+复苏+LPS(2 mg/kg体重);(3)PDS预治疗组(HLP组)：即失血性休克+复苏+PDS(25 mg/kg体重)+LPS(2 mg/kg体重)。

　　1.3 动物模型的建立 模型建立分为首次打击(手术创伤+失血性休克+复苏再灌注)、二次打击(内毒素血症)两个阶段。实验用材料、试剂等均无菌、无热源。(1)Wistar大鼠实验前禁食一夜，正常饮水，次日上午称重，用戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定于鼠板上，无菌条件下分离左侧颈总动脉插管后接三通，与YH4压力换能器相连，接RM6000型四导生理记录仪上，记录血压。无菌条件下分离股动、静脉，分别插管备用。(2)首次打击：待血压稳定10 min后缓慢自股动脉插管放血，并于15 min内使平均动脉压(MABP)降至40 mmHg，形成失血性休克。(3)首次打击后预治疗：通过股动脉放血的方法使血压在40 mmHg维持60 min后，再自股静脉回输自体肝素化血及至少1倍失血量的盐水，30 min内回输复苏，输液完毕后血压恢复达110 mmHg(基础血压的80%)左右。HLP组经腹腔注射PDS(25 mg/kg体重)，而HL组经腹腔注射等体积的葡萄糖溶液(5 ml/kg体重)。(4)二次打击：10 min后HL组、HLP组经腹腔注射LPS(2 mg/kg)，S组注射(5 ml/kg)生理盐水。

　　1.4 标本留取 二次打击后6 h，处死动物。留取血清标本，肺组织部分石蜡包埋，部分液氮冻存。

　　1.5 指标的检测

　　1.5.1 肺组织中AGT、ACE、AT1、AT2引物序列 见表1。

　　1.5.2 肺脏组织ACE及AngⅡ免疫组织化学观察 肺脏组织常规切片进行ACE及AngⅡ的免疫组织化学染色，所用抗体为ACE单克隆抗体(1∶800稀释)、AngⅡ多克隆抗体(1∶1 000稀释)(由大阪医科大学金德男博士惠赠)。

　　1.5.3 血清中AngⅠ及AngⅡ含量的测定 采用放免法测定AngⅠ及AngⅡ的含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书(天津市协和医药科技有限公司)进行。

　　1.6 统计学方法 实验数据采用x±s表示，目的基因及蛋白电泳条带密度值以灰度×面积/参照物的比值表示。采用SPSS11.0统计软件包处理，多组间比较用方差分析，两两比较采用t检验。表1 AT1、AT2、ACE、AGT的引物序列及扩增片段

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠肺脏组织中ACE、AGT、AT1、AT2的mRNA表达 如图1所示：与S组相比，HL组ACE、AGT mRNA表达水平明显增高(P<0.01)，HLP组明显低于HL组(P<0.05)。HL组AT1、AT2 mRNA与S组相比无明显差异(P>0.05)。与HL组相比，HLP组AT1、AT2 mRNA虽有降低趋势，但无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 各组大鼠肺脏组织中ACE蛋白的表达 对各组大鼠肺脏组织进行ACE免疫组化染色分析，如图2所示。S组肺组织中ACE蛋白呈微弱表达，且主要位于细胞浆;HL组肺组织中ACE蛋白呈强阳性表达;HLD组肺组织中ACE蛋白呈弱阳性表达;HLP组肺组织中ACE蛋白呈弱阳性表达。

　　2.3 各组大鼠肺脏组织中AngⅡ的蛋白表达 对各组大鼠肺脏组织进行AngⅡ免疫组化染色分析，如图3所示：S组肺组织中AngⅡ蛋白呈微弱表达，且主要位于细胞浆;HL组肺组织中AngⅡ蛋白呈强阳性表达。HLP组肺组织中AngⅡ蛋白基本呈弱阳性表达。

　　2.4 大鼠血清AngⅠ、AngⅡ的变化 二次打击6 h检测血清中AngⅠ及AngⅡ的变化，如表2所示：与S组相比，HL组AngⅡ的含量明显升高(P<0.05);与HL组相比，HLP组的AngⅡ的含量均明显减低(P<0.01);而AngⅠ的变化不明显。表2 二次打击6 h后血清AngⅠ、AngⅡ水平

　　3 讨 论

　　ALI/ARDS是指在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。其病理生理学基础是一种肺部失控的炎症反应，以肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞广泛损伤为其病理特征。临床表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，肺部影像学表现为非均一性的渗出性病变。目前认为肺内炎性因子和抗炎因子的平衡失调导致ALI的发生发展，内毒素血症在其发生发展过程中扮演着重要角色〔1〕。近年来的研究发现，对SIRS、ALI/ARDS的调控主要是通过对多种炎症介质及细胞因子调节实现的，NFκB是调控炎症反应强弱的核心〔2，3〕，这是由于在细胞因子的基因启动子上均含有NFκB序列，且NFκB的活化可促进它们的表达〔4〕。有研究表明，ALI/ARDS的炎症反应不仅仅通过NFκB的途径，也可通过其他的信号转导途径〔5〕。此外，在机体受到有害刺激后，RAS也被激活。体内有两套相对独立的RAS，肺组织在其中起着极其重要的作用。全身RAS中，ACE激活AngⅠ生成的AngⅡ主要作用在肺血管内皮。另外，肺组织还可通过局部RAS和非ACE途径自分泌和旁分泌产生内源性AngⅡ，它是强有力的肺血管收缩物质。近年来研究发现，Ang Ⅱ除具有调节血管张力、血流及促进细胞生长、增生等作用，还可调节细胞因子、化学趋化因子和黏附分子等多种炎症介质的表达，参与机体炎症相关疾病的发生和发展〔6〕。由于ACE在肺组织中的含量丰富，活性最强，促使AngⅠ转化为AngⅡ的作用强，且肺循环是体内唯一不使AngⅡ灭活的血管床，故肺循环流出的血液中AngⅡ的含量最高。已有实验表明，NFκB在Ang Ⅱ介导的炎症损伤中起着关键作用。本实验室多年的研究表明，PDS对失血性休克/内毒素休克时的血流动力学、生化指标、细胞及亚细胞结构、器官均有一定的保护作用，但具体的分子生物学机制尚不十分明确。因此本实验通过失血性休克，对大鼠造成第一次打击，然后通过腹腔注射LPS，对大鼠造成第二次打击，探讨二次打击造成ALI的机制。第一次打击之后，给予大鼠PDS预治疗，观察PDS对于二次打击大鼠的RAS系统相关基因表达的影响。结果证实，二次打击后的大鼠(HL组)肺脏组织中ACE、AGT mRNA表达水平明显增高(P<0.01)，而AT1、AT2 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05);免疫组化结果亦显示，ACE及AngⅡ表达明显增强;同时检测血清中AngⅠ、AngⅡ含量，HL组AngⅡ的含量明显升高(P<0.05)，而AngI的变化不明显。说明二次打击亦可以激活RAS，通过增加ACE、AGT的表达，使AngⅡ含量明显增加。AngⅡ是炎症反应的关键介质，体外实验证实AngⅡ可通过上调促炎因子和趋化因子的合成，激活炎症反应过程，而炎性细胞亦可产生AngⅡ，并可导致组织损伤的延长等〔7〕。因此，一方面Ang Ⅱ能够诱导炎性细胞活化和趋化，另一方面炎性细胞亦能激活RAS，增高炎症局部Ang Ⅱ的产生，进而影响炎症的进程。实验证明NFκB在Ang Ⅱ介导的炎症损伤中起着关键作用，而Ang Ⅱ通过AT1和AT2调节NFκB相关基因的表达，在多种炎性疾病的发生发展中发挥作用。

参考文献

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