胶体32P对原代培养大鼠前列腺细胞的内辐射研究

　　　　 作者：谷欣权 曹霞 孔祥波 马庆杰

【摘要】 目的 观察不同浓度胶体32P对原代培养大鼠前列腺细胞凋亡的影响。方法 原代培养大鼠前列腺细胞，分为大剂量辐射组、小剂量辐射组和对照组，采用流式细胞术、TUNEL染色和细胞活力测定检测大鼠前列腺细胞在不同辐射剂量下的细胞凋亡变化。结果 小剂量辐射组细胞凋亡率虽然很低，但是高于对照组(P<0.01)，大剂量辐射组细胞凋亡率明显高于小剂量辐射组和对照组(P<0.01)，并可见亚二倍体峰。与对照组比较，小剂量辐射组细胞活力下降(P<0.05)，大剂量辐射组细胞活力则明显下降(P<0.01)。结论 小剂量辐射对大鼠前列腺细胞的致死性损伤作用不大，仅能引起少量细胞凋亡，大剂量辐射可致大量细胞凋亡。

【关键词】 辐射;前列腺;细胞凋亡

放射性核素的电离辐射作为一种外界基因毒素，可诱发多种生物细胞凋亡，应用电离辐射诱导细胞凋亡的研究已经在免疫细胞和血管内皮细胞等领域取得重要进展，但辐射对大鼠前列腺细胞凋亡的影响尚未见报道〔1，2〕。本实验采用流式细胞术(FCM)、TUNEL染色和细胞活力测定，揭示不同剂量的β射线辐射对原代培养大鼠前列腺细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 10～20 w龄雄性Wistar大鼠30只，由长春市高新医学实验动物中心提供。动物随机分为大剂量辐射组(含有胶体32P，放射浓度4.11GBq/L)、小剂量辐射组(含有胶体32P，放射浓度2.06 GBq/L)和对照组(不含胶体32P)，每组10只。

　　1.2 大鼠前列腺细胞的原代培养 无菌切取大鼠前列腺叶，0.25%胰蛋白酶消化15 min，沉降弃上清， 0.25%胰蛋白酶消化10 min，上清移入无菌离心管中，加入2 ml培养液终止消化，离心，弃上清，再用培养液重复洗涤2次。沉淀的组织块加入胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，将各次消化所得细胞悬液集中混匀。在含10%小牛血清的MEM培养液中加入地塞米松1 μmol/L，EGF10 ng/ml，胰岛素5 μg/ml，前列腺上皮细胞生长因子10 ng/ml，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml作为基础培养液，调整细胞浓度为2×105/ml，接种于24孔培养板中，每孔1 ml，置于37℃ CO2培养箱中静止培养，每48 h更换培养液，细胞长满后进行实验。

　　1.3 FCM检测凋亡细胞DNA含量 将培养前列腺细胞用胰酶消化为单细胞悬液，70%乙醇固定，4℃过夜，贮存。将固定的细胞3 000 r/min，20℃离心5 min，弃上清，用PBS调整细胞浓度约106/ml，用4号针头过成单细胞悬液，加入终浓度为200 μg/ml的Rnase A，37℃水浴30 min。加入低渗荧光染料溶液，混匀后4℃避光染色30 min。用流式细胞计量仪摄取PI荧光，测凋亡细胞核百分率结果。

　　1.4 前列腺细胞TUNEL染色 将细胞接种于用多聚赖氨酸处理过的小盖玻片上，按上述方法进行培养，实验结束后细胞涂片用4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(PH7.0～7.6)室温下固定30 min。0.1 mol/L PBS和蒸馏水依次洗涤2 min×2次。加0.1 mol/L TBS 1∶200新鲜稀释蛋白酶K液 37℃消化10 min，0.1 mol/L TBS洗涤。加含有TdT 和DIGdUTP的标记液20 μl/片，37℃标记2 h，0.1 mol/L TBS洗涤2 min×3次。加封闭液50 μl/片，室温30 min，甩去封闭液。加封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体50 μl/片，37℃反应30 min，0.1 mol/L TBS洗涤。加0.1 mol/L TBS 1∶100稀释SABC，37℃反应60 min，0.1 mol/L TBS洗涤。DAB显色10～30 min，水洗。苏木素复染。常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。

　　1.5 前列腺细胞活力测定 以每孔103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μl。将培养板移入CO2孵箱中，在37℃，5% CO2及饱和湿度条件下，培养3～5 d后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，计算细胞存活率。

　　1.6 统计学处理 数据应用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 FCM检测前列腺细胞凋亡结果 对照组与小剂量辐射组细胞中未见明显的凋亡峰，大剂量辐射组凋亡细胞增多，并可见明显的亚二倍体峰。小剂量辐射组细胞凋亡率〔(3.84±0.77)%〕虽然很低，但是高于对照组〔(1.37±0.36)%〕(P<0.01);与小剂量辐射组及对照组比较，大剂量辐射组细胞凋亡率〔(8.26±2.12)%〕则明显增多(P<0.01)，并可见亚二倍体峰。

　　2.2 前列腺细胞的TUNEL染色结果 TUNEL染色阳性的凋亡细胞胞核中含有棕黄色的凋亡颗粒，胞核浓缩或裂解成碎块。坏死细胞体积增大，胞浆肿胀，核不规则。采用图像分析仪在每张细胞片上随机选取5个视野，计算细胞凋亡率，可见对照组〔(1.84±0.24)%〕与小剂量辐射组〔(3.93±0.51)%〕TUNEL染色阳性细胞率均很低;大剂量辐射组细胞凋亡率〔(17.5±4.3)%〕明显高于对照组与小剂量辐射组，差异具有显著性(P<0.01)。

　　2.3 前列腺细胞活力测定 用MTT法测定前列腺细胞的存活力，对照组存活率为(98.3±13.8)%，小剂量辐射组细胞活力下降(P<0.05)，存活率为(91.8±11.5)%。大剂量辐射组细胞活力明显下降(P<0.01)，存活率为(81.2±10.9)%。

　　3 讨 论

　　仅仅从整体器官水平研究前列腺疾病及其防治措施具有一定的局限性，利用体外培养的前列腺细胞能排除个体差异对实验结果的影响。本实验我们通过体外培养的大鼠前列腺细胞建立辐射诱导前列腺细胞凋亡的模型，用于观察不同辐射剂量对于前列腺细胞的生理功能、生化代谢和形态结构等变化的影响，探索β辐射致前列腺细胞凋亡的分子机制。

　　本实验分别采用流式细胞术、TUNEL染色、MTT法测定细胞活力等多种方法探讨小剂量辐射和大剂量辐射对体外原代培养前列腺细胞的影响，发现经胶体32P辐射并继续培养24 h后的前列腺细胞，对照组和小剂量辐射组贴壁生长良好，呈典型的上皮型细胞形态，细胞紧密相连，成片生长，但细胞间不重叠，而大剂量辐射组可见有散在的细胞核致密浓缩，嗜碱性增强，染成深蓝色，甚至有的细胞核固缩、碎裂。小剂量辐射组可见到少量的凋亡细胞，大剂量辐射组则出现明显的亚二倍体峰，凋亡细胞胞核中有棕黄色的凋亡颗粒，胞核浓缩或裂解成碎块。小剂量辐射组细胞活力下降，大剂量辐射组细胞活力明显下降。说明小剂量辐射仅能引起细胞增殖活性下降和一定比例的细胞凋亡，大剂量辐射不但使细胞增殖活性明显下降，而且导致大量的前列腺细胞发生凋亡。

　　电离辐射诱导细胞凋亡的机制复杂，细胞凋亡是一系列分子和生化因子调控的结果。辐射后前列腺内环境的改变能够引起许多在正常情况下受抑制的基因表达，如TRPM 2基因、P53基因、TGFβ及cmyc基因的活化，引起前列腺细胞凋亡〔3，4〕。应用胶体32P对体外培养前列腺细胞进行不同剂量内辐射的研究，结果表明，小剂量和小剂量率辐射，对前列腺上皮细胞的致死性损伤作用不大，与文献报道的相同〔5〕。辐射诱导细胞凋亡的过程中有许多基因参与调控和表达，其中p53基因发挥着关键作用。辐射导致DNA损伤，激活p53表达而诱导细胞凋亡。如果p53基因缺失，则表现为对辐射的耐受性。bcl2/bax基因在细胞凋亡的调节中具有重要的作用。应用β射线辐射后前列腺组织中bcl2/bax的比值下降，促使前列腺细胞趋于死亡〔6，7〕。本实验中大剂量辐射导致大量体外原代培养的前列腺细胞发生凋亡，其机制可能是电离辐射引起细胞中DNA分子损伤，激活的p53蛋白发挥转录子的作用，从而激活bax基因，使bax mRNA和蛋白质表达均升高，形成bax同源二聚体，并降低bcl2/bax的比例，诱导前列腺细胞凋亡〔8〕。

　　本实验的结果表明，小剂量、小剂量率的辐射既能有效抑制前列腺细胞增殖，又能保护细胞的结构完整及其存活力，避免大量细胞死亡带来的副作用。

参考文献

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