D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究

　　　　作者：魏晓东 刘玉萍 李晶 孙洁 欧芹

【摘要】 目的 研究D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化作用及菟丝子醇提液对其影响，探讨衰老发生的机制及菟丝子延缓衰老作用的机制。方法 采用D半乳糖制作衰老大鼠模型，观察15、30、45 d时的糖化血红蛋白(GHb)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)活性的变化。采用半定量RTPCR法测定大鼠胸主动脉糖化终末产物受体(RAGE)mRNA的表达，并观察菟丝子醇提液对其影响。结果 D半乳糖导致GHb、MDA和RAGEmRNA水平升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)，并呈现时间渐进性改变。菟丝子醇提液使大鼠GHb、MDA降低(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.01)，RAGEmRNA表达水平降低(P<0.01)。结论 D半乳糖诱导非酶糖基化发生，菟丝子醇提液抑制D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化反应，在给药30d即有显著的作用效果。

【关键词】 菟丝子;非酶糖基化;衰老;D半乳糖;大鼠

衰老的非酶糖基化理论认为糖基化造成的蛋白质的交联损伤是衰老的主要原因〔1，2〕，其反应在正常机体即缓慢进行，生物大分子无需酶的参加即可与氨基酸或核酸的氨基反应最终形成糖基化晚期终产物(AGE)〔3〕。研究表明随衰老在多种组织中出现AGE的增多，说明AGE在衰老及衰老相关疾病的发生机制中起一定的作用〔4～6〕，有些学者认为AGE可以作为衰老的生物学特征〔7〕。菟丝子常用作补益中药，药理学研究表明其具有补肾壮阳、提高机体免疫能力、调节内分泌、抗氧化等作用〔8～11〕。但关于菟丝子醇提液对衰老过程中AGE的影响及其作用机制国内外尚未见报道。本研究从衰老的非酶糖基化出发说明非酶糖基化与自由基代谢的关系及菟丝子对其作用，以进一步明确衰老的发生机制和菟丝子抗衰老作用的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品及实验动物 选用Wistar 雄性大鼠67只，体重180～220 g，由佳木斯大学动物实验中心提供(黑动字第99102001)。菟丝子购自佳木斯华伟大药房，由本校生药教研室鉴定。菟丝子以8倍乙醇回流提取，旋转蒸发器回收乙醇，余液浓缩至含6 g生药/ml，盐酸镁粉实验鉴定菟丝子醇提液中所含成分。

　　1.2 动物分组及处理 将67只大鼠随机分为青年组10只，衰老模型组27只，其中15、30和45 d组各9只;模型给药组30只，又分为给药15、30和45 d组每天各10只;各组正常饮食，衰老模型组每日上午按48 mg/kg体重颈背部皮下注射D半乳糖，按0.5 ml/100 g体重灌服温开水;模型给药组除按模型组注射D半乳糖外，每日按0.5 ml提取液/100 g体重灌服菟丝子醇提液，各组眼球取全血，并行颈椎离断，取样液氮保存备用。

　　1.3 指标的测定 红细胞SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法;全血MDA含量和糖化血红蛋白(GHb)测定采用TBA比色法，测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠胸主动脉AGE受体(RAGE)表达水平测定：取胸主动脉100 mg液氮中迅速研磨成匀浆，转入装有1 ml预冷Trizol的EP管中，室温静置15 min，加入0.2 ml氯仿，震荡30 s，冰上静置10 min后12 000 r/min，离心15 min，取上清液置另一管中，加等体积冷异丙醇，静置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，用70%乙醇洗2次后，4℃ 12 000 r/min，离心5 min，弃上清，真空离心干燥5～10 min，沉淀用水溶解。RNA样品处理：37%甲醛3.5 μl，10×MOPS 2 μl，RNA样品溶液4.5 μl，甲酰胺10 μl，混匀，68℃温育15 min，冰浴15 min，加入10×上样缓冲液2 μl混匀。采用电泳凝胶成像系统观察RNA分离情况和28 S rRNA与18 S rRNA的情况。采用DU800核酸蛋白检测仪测定RNA纯度。RTPCR法合成RAGE DNA：cDNA反应体系：引物选择Oligo dT18Adaptor Primer按程序操作，5×RNA PCR缓冲液5 μl，无RNA酶h3O 6.5 μl，dNTP 混合物4 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，AMV逆转录酶1 μl，Oligo dT上样引物1 μl，RNA样品2 μl，混匀，移入PCR仪，42℃ 60 min;95℃ 5 min;1循环。PCR反应：采用βactin作内参，引物5′GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′(扩增产物513 bp);RAGE引物5′ATGAGCAGAGCGGCTATTCC3′，5′CACGCTTCGGTCAGAGCTCA3′(扩增产物530 bp)。94℃ 5 min，1循环，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 80 s;34个循环，72℃ 7 min。PCR产物以凝胶成像系统扫描，测定光密度值并计算RAGE/βactin光密度比值。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS12.0统计分析软件，实验数据用x±s表示，进行方差分析，q检验。

　　2 结 果

　　2.1 菟丝子醇提液对大鼠主动脉RAGEmRNA表达的影响和GHb含量的影响 结果见图1、表1。扩增后得到βactin 513 bp和RAGE 530 bp两个片段，βactin与RAGE扩增条件完全一致。图象分析结果显示：与青年组相比模型组和给药组大鼠RAGEmRNA表达增加(P<0.01，P<0.05);与模型组比较给药组RAGEmRNA表达降低(P<0.01)。模型组和给药组各时间点亚组间RAGEmRNA差异显著(P<0.01)。模型组GHb含量明显高于青年组(P<0.01);与模型组相比，给药组30、45 d GHb含量均降低(P<0.01)。模型组和给药组内，与15 d比较，给药30、45 d GHb含量均明显降低(P<0.05)。

　　2.2 菟丝子醇提液对MDA含量和SOD活性的影响 见表2。模型组MDA含量较青年组明显升高(P<0.01)，给药组30、45 d MDA显著低于模型组(P<0.01)，可达到青年组水平。给药组各时间点亚组比较，MDA含量差异显著(P<0.01，P<0.05)。模型组SOD活性明显低于青年组(P<0.01);与模型组相比，给药组30、45 d SOD活性升高明显，其中45 d组可达到青年组状态。与15 d比较，模型组30、45 d SOD活性明显降低(P<0.05，P<0.01)，与15 d比较，给药组30、45 d SOD活性升高明显(P<0.01)。表1 菟丝子醇提液对大鼠RAGEmRNA表达GHb含量的影响(与青年组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与模型组比较：3)P<0.01;与15 d组比较：4)P<0.05，5)P<0.01;与30 d组比较：6)P<0.05，7)P<0.01，下表同　表2 菟丝子醇提液对MDA含量和SOD活性的影响

　3 讨 论

　　动物连续注射D半乳糖导致细胞代谢障碍，最终导致衰老，是一种成功可靠的实用衰老模型〔12，13〕。本研究结果说明D半乳糖导致大鼠GHb、MDA水平明显增高，SOD活性下降，出现衰老的改变。大鼠主动脉RAGEmRNA表达水平升高。RAGE的高表达、GHb的升高与衰老模型发生过程中自由基的清除能力下降表现密切的相关性。并随衰老的发生呈递增的趋势，说明RAGE在衰老时不断堆积。因GHb与血红蛋白的AGE呈明显的正相关〔14〕，而非酶糖基化累积的结果，最终导致细胞功能减退和器官功能的降低。而AGE常发生在胶原蛋白上，这种变化势必加重老年动脉硬化等血管病的发生。菟丝子醇提液能调节自由基代谢，降低RAGEmRNA的表达。RAGEmRNA表达的器官有AGE的结合蛋白，并存在AGE的形成或聚积，提示RAGEmRNA上调可能是致衰的重要途径。本研究中提示应用菟丝子醇提液可使RAGEmRNA表达下调，进而减少AGE对蛋白质、核酸、脂类的修饰作用，减少交联的形成，改善细胞的功能而发挥延缓衰老的作用。菟丝子醇提液在给药30 d即发挥出了理想的效果。但关于菟丝子醇提液中的主要成分总黄酮发挥这种作用的最有效成分尚需进一步的实验证明。

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