作者：李军林， 舒青，郑强荪，冯蕾
【关键词】 ，雌激素受体基因
【Abstract 】 AIM: To study the distribution of ER intron 1 polymorphism in Han population of different ages and sexes in Shaanxi Province. METHODS: AmplificationRestriction Fragment length Polymorphism (AmpRFLP) was used to analyze the polymorphism of Han population in Shaanxi Province. The templates of PCR were extracted from 162 independent cases of different ages and sexes in Shaanxi Province. RESULTS: ① The full length of ER intron I after PCR was 1.3 kb. ② Using restriction endonuclease enzymes， three types of genotypes were obtained: Pvu II: P/P (1.3 kb)， P/p (1.3 kb， 850 and 450 bp) and p/p (850 bp， 450 bp). ③ Using restriction endonuclease enzymes， another three types of genotypes were obtained: Xba I : X/X (1.3 kb)， X/x （1.3 kb， 910 and 390 bp）and x/x（910 bp， 390 bp）. CONCLUSION: It is suggested that ER gene intron 1 of Han population in Shaanxi Province is polymorphism. The distribution of the genotype is not related to different age groups and different gender groups.
【Keywords】 ER gene；gene polymorphism；Han population in Shaanxi province
【摘要】 目的: 分析陕西省不同年龄和不同性别的汉族人群雌激素受体(ER)基因1号内含子基因多态性分布情况. 方法: 研究基于PCR后Pvu II和Xba I的酶切结果，PCR模板DNA来自陕西省162例无关个体，研究对象分为不同年龄和不同性别两组. 结果: ①PCR扩增ER基因的DNA片段长度为1.3 kb;②经PvuⅡ酶切，得到3种ER基因型：P/P型(1.3 kb)，P/p型(1.3 kb
，850和450 bp)，p/p型(850和450 bp)；③经Xba I酶切得到的3种1号内含子基因型为：X/X型（1.3 kb），X/x型（1.3 kb，910和390 bp）和x/x型（910和390 bp）. 结论: 在陕西汉族非相关正常人群中ER基因1号内含子存在多态性，基因型分布与年龄和性别不存在相关性.
【关键词】 雌激素受体基因；基因多态性；陕西汉族人群
0引言
限制性片段长度多态性在基因组中普遍存在，据估计，人体基因组中平均异质性约为1‰~5‰. 基因位点的多态性会影响基因的转录表达，进而通过影响基因产物来影响相关的生理功能［1］. 在对动脉粥样硬化遗传易感性研究过程中，发现女性在绝经前发病率明显低于男性，但绝经后与男性发病率相近，而动脉粥样硬化与雌激素的关系表明女性通过雌激素受体途径拮抗动脉粥样硬化. 我们采用AmpRFLP技术对陕西汉族正常人群的雌激素受体基因（estrogen receptor gene， ER gene）多态性分布进行初步研究，希望有助于从DNA水平更深入地了解ER基因多态性是否存在性别差异和年龄变化，以及相关疾病发生机制.
1对象和方法
1.1对象
随机抽取162（男98，女64）例体质健康个体外周血血样，均为陕西省无血缘关系人群.
1.2方法
对162例研究对象按照年龄和性别分为:少年组（7～18岁）37例，成年组（19～40岁）72例，老年组（60～74岁）53例；按照性别分为男女两组，男98例，女64例. 分别取静脉血3~5 mL，生理盐水洗去血浆，加入STE， SDS和蛋白酶K，37℃过夜消化，酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)抽提，无水乙醇和醋酸钠沉淀，制备基因组DNA. 引物序列分别为：5′CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC3′， 5′TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA3′. PCR反应体系50 μL，依次加入灭菌双蒸水32 μL，10×Buffer （含Mg2+）5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，引物各2.5 μL，模板DNA 3 μL. 97℃预变性7 min，加入Tag酶1 μL（4 mmol/L），94℃变性30 s，61℃复性40 s，72℃延伸90 s，共30个循环，循环结束后72℃延伸10 min. 取PCR扩增产物8 μL，14 g/L琼脂糖凝胶30 mA电泳30 min，观察PCR结果. 取20 μL PCR扩增产物，无水乙醇和醋酸钠沉淀，晾干后加入灭菌双蒸水15.5 μL溶解，加入Buffer B 2 μL， Acetylated BSA 2 μL 和6 U Pvu II和Xba I于37℃分别酶切3～4 h. 酶切产物经15 g/L琼脂糖凝胶（含溴乙锭）电泳分离，在紫外灯下判读并照相记录结果.
统计学处理：基因频率用直接算法，并按HardyWeinberg平衡原理确认样本的群体代表性. 不同年龄、性别间等位基因频率差异用χ2检验.
2结果
在正常人群中ER基因1号内含子分别存在3种等位基因片段：P/P， P/p， p/p， X/X， X/x和x/x型，琼脂糖凝胶电泳显示分别为1条、3条和2条带，大写字母表示存在点突变而使该酶切位点消失，小写字母则表示存在该酶切位点. 陕西汉族正常人群ER基因1号内含子经PCR后结果为1.3 kb大小的1条带，经Pvu II酶切可区分出3种基因型：P/P型(1.3 kb)，P/p型(1.3 kb，850和450 bp)，p/p型(850和450 bp)（Fig 1A）. Xba I内切酶区分出的3种基因型分别为：X/X型（1.3 kb），X/x型（1.3 kb，910和390 bp）和x/x型（910和390 bp）（Fig 1B）. 陕西汉族人群中ER基因1号内含子PCR片段为1.3 kb，经Pvu II和Xba I酶切，以P/p和x/x基因型分布最为广泛. 经Pvu II酶切基因频率分布范围为0.08~0.57，经Xba I酶切基因频率分布范围为0.05~0.53. P基因频率为0.35，p基因频率为0.65；X基因频率为0.28，x基因频率为0.72. 不同年龄组之间ER基因Pvu II酶切多态性分布无统计学差异（χ2=0.648， P＞0.95），Xba I酶切多态性分布无统计学差异（χ2=2.365， P＞0.50， Tab 1）. 性别之间差异也不显著：ER基因Pvu II酶切多态性分布差异（χ2=0.621， P&>0.70），Xba I酶切多态性分布差异（χ2=0.599， P&>0. 70， Tab 2）. 即ER基因PCR扩增片段Pvu II与Xba I酶切多态性与年龄和性别不存在相关性.表1不同年龄组ER基因1号内含子Pvu II和Xba I酶切结果（略）表2不同性别ER基因的内含子Pvu II和Xba I酶切结果（略）
ER基因位于6q2427，野生型全长140 kb. 其1号内含子有两个高度多态性的AFLP位点，因其特殊位置可能会影响基因转录，所以引起研究者的关注. Ushiroyama等［2］对日本42~46岁绝经后妇女的骨矿密度与雌激素受体基因1号内含子多态性关系研究，发现骨矿密度与基因型之间的差异型：PPXx杂合子基因型个体的骨矿密度明显偏低，但与其他基因型无显著关联；SapirKoren等［3］对183例18~84岁的男性和161例23~79岁女性进行骨矿密度和ER基因多态性相关性研究，发现男性ER基因多态性与骨矿密度存在相关性趋势，但不存在显著的统计学意义，女性ER基因多态性与骨矿密度之间无相关性. Matsushita等［4］对133例怀孕妇女骨矿密度与ER关系研究揭示两者之间存在相关性. 在对动脉粥样硬化遗传易感性研究过程中，我们发现女性在绝经前发病率明显低于男性，但绝经后与男性发病率相近［5］，而雌激素的分泌与年龄不存在相关性［6］. 本研究结果显示，从少年组到老年组，ER基因1号内含子Pvu II 和 Xba I两个与动脉粥样硬化遗传易感性相关的位点均有多态性分布，P/P，X/X较少见，P/p和x/x基因型分布频率较高；结果与日本人种群基因频率相似［2，3］；ER基因在正常男性和正常女性中分布频率极为相近，不存在性别差异. ER基因1号内含子Pvu II和Xba I两个研究位点不存在变化，说明在不同性别和不同年龄组之间，对动脉粥样硬化遗传易感性的敏感性和替代疗法存在的差异与其他限制性酶切位点可能存在相关性. 结合Shiozawa等［7］实验，说明也可能与其他位点或者与ER基因其他的多态性形式如甲基化等相关.
【参考文献】
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［7］ Shiozawa T， Itoh K， Horiuchi A， et al. Downregulation of estrogen receptor by the methylation of the estrogen receptor gene in endometrial carcinoma［J］. Anticancer Res，2002；22(1A):139-143.