作者：沈青，杨存明，张国成，姚裕家，付雪梅
【关键词】 细胞周期蛋白类
【Abstract】 AIM： To explore the effects of excessive thymidine on the expression of cyclin A， B， D1 in each phases of cell cycle by studying the relationship between cyclin and DNA synthesis and the mechanism of cell cycle transition. METHODS： Neonatal pigs renal tubular epithelial cells were synchronized by the excessive thymidine block technique and the distribution of G1， S， G2 phases were determined by flow cytometry. The expression of cyclin A， B， D1 were detected by immunocytochemistry. RESULTS： Flow cytometry analysis revealed that (99.5±0.8)% of the neonatal renal tubular epithelial cells were at G1/S transition， (90.5±0.7)% in S phase and (93.5±2.2)% in G2 stage respectively by the method of the excessive thymidine block technique. The expression of cyclin A at G2 phases was higher than that of G1/S and S phases (average of gray level: 136.28±2.65， 145.04±1.35， 147.52±1.84，P&<0.01). The expression of cyclin B was G1G1/S&>S (average of grey level: 132.60±1.92， 146.69±1.32，158.84±1.07， P&<0.05). CONCLUSION： The block of DNA synthesis with double excessive thymidine may be associated with the change of cyclin expression.
【Keywords】 thymidine；cyclins; kidney Tubules;epithelial cells
【摘要】 目的: 探讨过量胸苷干扰细胞周期素细胞周期时相表达的特点，为进一步研究细胞周期转化以及细胞周期素与DNA合成的关系奠定基础.方法: 应用二次过量胸苷阻断法进行新生猪肾小管上皮细胞体外同步化培养，采用流式细胞术进行鉴定；然后分别进行G1/S，S及G2期细胞CyclinA，B，D1mAb免疫细胞化学染色并进行图像分析.结果: 二次过量胸苷阻断法可获取G1/S界面细胞为(995±08)%，S期细胞为(905±07)%，G2期细胞为(935±22)%，G2/G1=220.G1/S，S，G2细胞CyclinA表达特点为G2期大于G1/S和S期（目标灰度值：1363±27，1450±14，1475±18，P&<001），CyclinB表达特点为G1/S期小于S和G2期（目标灰度值：1556±16，1488±22，1366±26，P&<001），CyclinD1的表达特点为G2期大于G1/S期(目标灰度值：132.6±1.9，146.7±1.3，P&<0.01)，S期小于G1/S期（目标灰度值：1588±11，1467±13，P&<005）.结论: 二次过量胸苷阻断细胞DNA合成可能与细胞周期素表达的改变相关.
【关键词】 胸苷；细胞周期蛋白类；肾小管；上皮细胞
0引言
两次过量胸苷阻断法是首先被人们证实较为可靠的细胞体外同步化方法而被广泛应用［１］.脱氧胸腺核苷合成增加导致DNA合成的抑制是其细胞同步化的经典学说.然而，随着细胞周期调控机制研究的深入，细胞周期素在细胞转化过程中具有关键性的作用.为此，探讨细胞周期素在二次过量胸苷同步化细胞中的表达特点，为进一步研究细胞周期素与DNA合成的关系奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1细胞及主要试剂传4~5代新生猪肾小管上皮细胞［２］.胸苷（Sigma产品，终浓度为2mmol・L-1）；低糖DMEM，1250胰蛋白酶（Gibco产品）；cyclinD＼A＼BmAb，生物素化二抗，SABC，DAB显色试剂盒(博士德生物工程公司产品)；胎牛血清（天津生物制品研究所）；CYCLE TESTTM PLUS DNA试剂盒（BD公司产品）.
1.1.2主要仪器设备万级层流工作室、BCM100型生物洁净工作台、WJ6C型CO2培养箱（日本平泽产品）、倒置显微镜（Olympus ， Nippon）、低温低速离心机、普通离心机、FACSCalibur流式细胞仪（BD公司产品）.Mias2000图像分析系统（四川大学图像研究所研制）.
12方法
1.2.1肾小管上皮细胞同步化培养［３］正常培养细胞3~4 d，达到大约50%-70%的覆盖率；加入胸苷（thymidine），使其终浓度为2 mmol・L-1，继续培养16~18 h，使细胞停留在G1/S期边界；吸去培养液，洗1～2次，用新鲜的培养液培养12 h；加入终浓度为2 mmol・L-1的胸苷，继续培养20h；吸去培养液，洗1～2次，收集G1/S期细胞；在诱导的G1/S期细胞中，加入新的培养液，继续培养3h，收集S期细胞；在诱导的G1/S期细胞中，加入新的培养液，继续培养8 h，收集G2期细胞.并配制1×106・mL-1 细胞悬液备用.
1.2.2流式细胞术DNA检测［４］DNA含量用ModFit 2.0和WinMDI 2.8软件分析.
1.2.3常规免疫细胞化学［５］结果在Mias2000图像分析系统分析.
统计学处理：平均目标灰度值以x±s表示，应用国际通用SPSS（Vol.10.0）进行单因素的方差分析.两两均数的比较应用Dunnett进行分析.
2结果
2.1新生猪肾小管上皮细胞各细胞周期时相获取比例将获取的G1/S，S，G2细胞进行FACS检测，激发光为氩离子激光488 nm谱线，建立FL2A直方图，ModFit 2.0软件进行数据分析，结果如Fig 1所示.3组细胞DNA覆盖比较应用WinMDI 2.8软件分析，结果如Fig 2.G1（99.5±0.8）%，S（905±07）%，G2（935±22）%.
图1G1期细胞DNA（略）
Fig 1The resulting gated DNA histogram（略）
图2G1，S，G2细胞DNA（略）
Fig 2The resulting gated DNA histogram displaying staining of G1 phase displaying staining of G1，S，G2 phases（略）
2.2CyclinA＼B＼D1在各细胞周期时相表达的特点G2期新生猪肾小管上皮细胞cyclinA目标平均灰度明显低于G1后期(P&<0.01)，而G1后期与S期细胞的目标平均灰度差异无统计学意义（P&>0.05）.提示cyclinA在G2期新生猪肾小管上皮细胞中的表达明显高于G1后期和S期（Tab 1）.cyclin B随着细胞周期由G1后期→S期→G2期的进展，其表达具有逐渐增高的趋势（P&<0.01，Tab 1）.新生猪肾小管上皮细胞cyclin D1平均目标灰度值为G2
Tab 1Comparison with average of grey level of cyclin A＼B＼D1 at G1/S ，S and G2 phases（略）
3讨论
研究细胞周期相关过程的一个基本的、可能是首要的任务就是使细胞同步于细胞周期的某一时相.二次过量胸苷阻断法在研究G1/S界面细胞事件对S和G2时相事件的影响最为有利［６］.过量胸苷可致细胞内脱氧胸苷量增加4~5倍，然而，其抑制DNA合成的机制仍不明确.是否与干扰细胞周期素表达有关？国内外文献无明确结论.
Gong等［７］人研究发现过量胸苷可导致G1/S界面白血病MOLT4细胞cyclin B1增加4倍，cyclin A增加2倍，而cyclin D3则无明显变化；而在S期细胞cyclinA/B1的表达则具有下降趋势.然而，Ioakim等［８］实验结果显示，G1/S界面动脉内皮细胞周期的停止与下调cyclin A的表达有关；小剂量胸苷可以部分逆转5FU对胸苷相关合成酶（thymidylate synthetase）的抑制作用［９］；S和G2期cyclin B1表达不依赖于DNA合成周期［１０］.
为此，我们首先采用二次胸苷阻断战略进行新生猪肾小管上皮细胞的体外同步化培养，经流式细胞术鉴定，可获取G1后期细胞995%左右，S期细胞905%左右，G2期细胞约93.5%左右.cyclinA在G1/S界面和S期新生猪肾小管上皮细胞均有表达，以G2期表达为最高；cyclin D1的表达以S期为最低，G2期高于G1/S界面的表达［１１］；cyclinB的表达随着G1/S→S→G2时相的进展，具有逐渐上升的趋势，提示cyclinB的半衰期可能延长［７］.因此我们推测，过量胸苷导致细胞停留在G1/S界面可能与cyclinA表达下调［８］，cyclinD1［１１］的上调相关.不过，Dulic等［１］研究显示，过量胸苷主要导致细胞周期素依赖性激酶活性的下降，其中磷酸化状态是它们活性功能的关键.因此它们之间的关系还有待于进一步研究和探讨.
【参考文献】
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