【关键词】 白细胞介素8
关键词: 白细胞介素8;大鼠;垂体，前叶;雌二醇
摘 要:目的 研究孕鼠和大鼠性周期不同阶段以及大鼠体内雌激素水平变化对垂体前叶（Anterior pituitary，AP）内IL-8样免疫阳性物质表达的影响. 方法 免疫组织化学ABC法. 结果 IL-8样免疫阳性物质在雌性大鼠性周期不同阶段有所差异，在动情期，垂体边缘IL-8样强染阳性细胞数明显增多;妊娠20d大鼠的垂体前叶中央部分阳性细胞染色强度明显增加.双侧卵巢摘除大鼠和正常雌性大鼠皮下注射25μg・（kg・d）-1 苯甲酸雌二醇2wk后，也能观察到相同结果. 结论 大鼠体内雌激素水平能影响垂体前叶内IL-8样免疫阳性物质的含量.
Abstract:AIM To investigate changes in IL-8like im-munoreactive substance in the anterior pituitary（AP）of pregnant rats and rats at different estrous stages and in dif-ferent estradiol levels in vivo.METHODS Immunohis-tochemistry was used.RESULTS The IL-8like immunore-active substance changed during rat estrous cycles and numer-ous strongly stained cells were found in the shallow part of AP at the estrus stage.Increases in the intensity of IL-8im-munostaining in the central part of AP were found in rats with30days of pregnancy.Similar results were found at nor-mal or ovariectomized rats after the injection of25μg・（kg・d）-1 estradiol for two weeks.CONCLUSION Estradiol lev-el in vivo could influence the intensity of IL-8like immunore-active substance in AP.
0 引言
越来越多的实验证据表明，神经、免疫和内分泌三大系统可共享信息分子及其受体［1，2］ .白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）是一种主要由单核-巨噬细胞合成和分泌的免疫趋化因子，在炎症反应中起重要作用.我室以往的研究［3］ 发现，大鼠垂体前叶存在IL-8样免疫阳性物质，且有特殊的分布格局，即强染阳性物质主要分布于前叶的浅层部分，中间部分则为弱染阳性细胞.有研究显示，机体雌激素水平变化可显著性影响某些细胞因子的表达，如雌激素能抑制大鼠子宫蜕膜细胞IL-6及IL-6R的表达［4］ ;雌激素可抑制大鼠垂体TGF-β免疫阳性细胞的数量［5］ .为研究雌激素对大鼠垂体前叶IL-8样免疫阳性物质表达可能的调控作用，本实验应用免疫组织化学方法，研究了孕鼠和大鼠性周期不同阶段垂体前叶内IL-8样免疫阳性物质表达的变化，以及大鼠体内雌激素水平变化对垂体前叶内IL-8样免疫阳性物质水平的影响.
1 材料和方法
1.1 雌性大鼠性周期不同时期的确定 成年雌性SD大鼠20只（第四军医大学实验动物中心提供），通过阴道涂片观察到至少有2个稳定性周期以后，在适当的周期阶段（每个周期阶段5只大鼠）处死，取材，包埋.
1.2 动物模型 成年雌性SD大鼠20只，体质量200～230g，随机分为4个实验组，每组5只，分别为:①双侧卵巢摘除组（Ovariectomy，OVX）;②双侧卵巢摘除加油剂对照组（OVX+Vehicle，OVX+V）;③双侧卵巢摘除加苯甲酸雌二醇组（OVX+E2 ）;④正常加苯甲酸雌二醇组（Normal，NOR+E2 ）.苯甲酸雌二醇（上海第九制药厂）的给药量为5μg・（只・d）-1 （sc），溶于芝麻油（0.2mL/只，于卵巢摘除次日起开始给药.正常鼠给药时间与卵巢摘除鼠给药时间同步，每日下午5:30～6:00给药，给药时间为14d.
1.3 动物取材 SD大鼠以戊巴比妥钠（30mg・kg-1 ）麻醉后，经左心室灌注生理盐水100～150mL至血液冲净，以肝叶发白为标志.迅速开颅，取垂体入Bouin’s固定液（饱和苦味酸75mL+甲醛25mL+冰乙酸5mL）固定5h后常规石蜡包埋.从腹侧向背侧行6μm水平切片，隔5张取一张，贴于预先经铬矾明胶处理的载玻片，37℃烤箱过夜.常规脱蜡后，即可进行免疫组织化学染色.
1.4 免疫组织化学染色 采用常规生物素-抗生物素-过氧化物酶复合物（ABC）方法.第1抗体为兔抗人IL-8（1∶2000，第四军医大学免疫学教研室提供）4℃孵育48h;生物素化的二抗（1∶500，Sigma公司），室温3h;过氧化物酶标记的抗生物素-生物素复合物（1∶500，Sigma公司），室温2.5h，DAB+0.6μL・L-1 h3 O2 显色，免疫阳性产物为棕黄色.以PBS或正常血清替代一抗染色作为阴性对照.
1.5 实验结果观察和数据处理 用LEICA Q500MC图像分析系统，采用双盲法，输入方式为普通光源照明，显微镜放大倍数400倍，固定输入条件后，在高分辨图像监视器上每张切片中央部分随机抽取5个视野，选择合适的门限分割值，测定阳性细胞的平均灰度，每只动物取5张切片，计算其均值，以t检验法计算各组间差异.
2 结果
2.1 IL┐8样免疫阳性物质在正常雌性大鼠垂体中的存在和分布 正常雌性大鼠垂体前叶存在IL-8样免疫阳性物质，阳性染色物质存在于胞质.阳性细胞的分布有特殊规律.强染阳性细胞分布在垂体的边缘部分，中央部分则是一些染色相对较弱的阳性细胞（Fig1）.
2.2 IL┐8样免疫阳性物质在妊娠大鼠垂体中的存在和分布 妊娠10d雌鼠垂体前叶IL-8免疫染色与正常雌鼠相似;妊娠20d雌鼠的垂体可见明显增大，其染色结果与正常雌性大鼠相比有所不同，强染 的阳性细胞数目明显增加，且不局限于垂体的边缘部分而弥散分布于整个垂体前叶（Fig2）.
2.3 IL┐8样免疫阳性物质在大鼠性周期不同阶段的变化 正常雌性大鼠垂体前叶边缘的IL-8样强染阳性细胞的数目随着雌性大鼠性周期不同阶段而变化.其变化规律为:在动情间期和动情前期最少，在动情期显著增多（P&<0.01），到动情后期，强染阳性细胞数目开始回落，但与动情间期和动情前期相比仍显著较多（Fig3）.
2.4 大鼠体内雌激素水平对垂体IL┐8样免疫阳性物质的影响 大鼠行OVX后，饲养14d，其垂体IL-8样免疫阳性物质的存在和分布与正常大鼠相似;术后每日皮下注射苯甲酸雌二醇组（OVX+E2 ），其垂体明显肥大，垂体前叶内IL-8样免疫阳性物质的存在和分布与妊娠20d雌鼠相似，强染阳性细胞弥散分布于整个垂体前叶;术后皮下注射对照油剂组（OVX+V）垂体染色与OVX组相似;正常雌性大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇组（NOR+E2 ）垂体染色与OVX+E2 组一致.对各组大鼠垂体前叶中央部分阳性细胞的染色强度进行图像分析并做团体t检验，发现OVX组和OVX+V组染色无显著差别，与它们相比，OVX+E2 和NOR+E2 及妊娠20d雌鼠垂体前叶中央部分染色强度均有显著性升高（P&<0.01，Fig4）.
3 讨论
雌激素是一种重要的性激素，近年的研究表明雌激素也具有免疫调节作用［1］ .雌激素能调节多种细胞因子的合成和分泌.目前的研究显示，性激素对IL-8合成和分泌也有调控作用，如Sunyer等［6］ 发现雌激素可以抑制IL-1介导的破骨细胞IL-8mRNA的产生.Critchley等［7］ 发现在在体情况下孕酮撤除后子宫内膜IL-8mRNA有显著性增加.Arici等［8］ 用人的子宫内膜基质细胞单层培养发现孕酮和一种合成的孕激素醋酸甲羟孕酮（MPA）能提高IL-1促进IL-8mRNA的作用. 转贴于 雌激素能否影响垂体前叶IL-8的表达，未见报道.我们的实验结果表明，IL-8样免疫阳性物质随着雌性大鼠性周期不同阶段的变化而发生规律性变化，动情期大鼠垂体边缘IL-8样强染免疫阳性细胞明显较多.大鼠血清中的LH，FSH，PRL、孕激素浓度在动情前期的后期达到最高峰，雌二醇的浓度则是在动情前期的中期达到最高点
［9］ .该结果提示性激素可能影响垂体细胞IL-8的表达.本实验对妊娠10d和20d的雌鼠进行垂体染色，可见到妊娠20d的雌鼠垂体前叶中央部分阳性细胞的数目和染色强度的显著性增加.Escalada等［10］ 对妊娠8，15和20d的大鼠血浆内的雌二醇及孕激素的浓度进行了检测，发现雌二醇浓度在孕期中逐渐增加，在妊娠20d达到最高峰;而孕激素浓度15d时达到最高峰，而在20d时剧降至其峰值的一半.提示大鼠妊娠期间体内雌激素水平的增加可能是导致妊娠20d大鼠垂体前叶中央部分IL-8样免疫阳性物质增加的原因.为进一步研究雌激素对IL-8的可能作用，我们进行了大鼠卵巢切除及激素替代实验，发现大鼠OVX后，垂体前叶IL-8样免疫阳性物质没有显著变化，OVX后每日皮下注射5μg雌二醇2wk和正常大鼠皮下注射雌二醇后，垂体前叶中央部分出现了众多强染阳性细胞，而皮下注射对照油剂的OVX大鼠染色与OVX组相似.该结果表明，大鼠体内雌二醇水平的升高的确能够影响大鼠垂体前叶细胞内的IL-8样免疫阳性物质含量，使原来非阳性或弱阳性的深层细胞IL-8样免疫阳性物质含量显著增加，可能具有上调作用.
图1 －图3 略
大鼠卵巢切除后，体内雌激素合成减少，但垂体内IL-8样免疫阳性物质并未发生明显变化，可能是因为大鼠体内其他组织如肾上腺等也能产生雌激素，而多种皮质激素也可经一定反应转化为雌激素，具有替代作用，使体内雌激素浓度维持在一定的水平;实验结果也可能提示体内类似于雌激素结构的物质具有类似的作用.在妊娠雌鼠，其体内雌激素远远高过正常水平，卵巢切除后注射的雌激素的量也高过正常水平，从而可能使垂体内的IL-8样免疫阳性物质大大增加.IL-8样免疫阳性物质在正常大鼠垂体前叶的稳定产生，提示IL-8可能在垂体前叶发挥某种特定的作用.研究表明，多种细胞因子都能影响垂体前叶激素的释放及垂体前叶细胞的增殖.Sawada等［11］ 发现IL-8家族中的CINC/GRO能显著促进垂体前叶催乳素（PRL）的释放.Green等［12］ 检测了17例人垂体瘤活检组织中各种细胞因子的表达水平，发现17例垂体瘤均有IL-8转录产物的存在，提示IL-8可能对垂体瘤的发生、生长或分化有一定的作用.雌激素是一种重要的性激素，其合成释放受下丘脑-垂体前叶激素的调节.雌激素可反馈作用于垂体腺，大鼠体内雌激素水平持续增加会导致垂体肥大，垂体细胞特别是PRL细胞增多和PRL分泌增加，甚至引发PRL垂体瘤.雌激素浓度的增加会导致大鼠垂体前叶细胞IL-8样免疫阳性物质的增多，提示IL-8可能作为垂体前叶内的一种旁分泌或自分泌因子，对垂体细胞特别是PRL细胞的生长、增殖和/或激素分泌起促进作用.而其具体的作用如何仍需进一步的研究.
图4 略
参考文献
［1］Jin BQ，Li ES，Xu H，Zhang WH，Liu Y，Xia HB，Sun K.Cel-lular and molecular immunology ［M］.Xi’an Shijie TushuChuban Gongsi（Xi’an:World Books Publishing Company）， 1995:335-367.
［2］Wei GZ，Zhu YL，Wang GF，Han XF，Hu YZ，Zhong YQ，Chen JK.Expression of IL-2mRNA in rat anterior pituitary ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（3）:201-203.
［3］Zhong YQ，Zhu YL，Zhang WH，Chen JK，Wang GF，Jin BQ.Existence and localization of interleukin-8like immunoreactive substances in rat anterior pituitary ［J］.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（6）:698-701.
［4］Deb S，Tessier C，Prigent-Tessier A，Barkai U，Ferguson-Gottschall S，Srivastava RK，Faliszek J，Gibori G.The expres-sion of interleukin-6（IL-6），IL-6receptor and gp130-kilodalton glycoprotein in the rat decidua and a decidual cell line:Regula-tion by17beta-estradiol and prolactin ［J］.Endocrinology，1999;140（10）:4442-4450.
［5］Burns G，Sarkar D.Transforming growth factor-β1-like im-munoreactivity in the pituitary gland of the rat:Effect of estro-gen ［J］.Endocrinology，1993;133（3）:1444-1449.
［6］Sunyer T，Lewis J，Collin-Osdoby P，Osdoby P.Estrogen’s bone-protective effects may involve differential IL-1receptor regulation in human osteoclast-like cells ［J］.J Clin Invest，1999;103（10）:1409-1418.
［7］Critchley HO，Jones RL，Lea RG，Drudy TA，Kelly RW，Williams AR，Baird DT.Role of inflammatory mediators in hu-man endometrium during progesterone withdrawal and early pregnancy ［J］.J Clin Endocrinol Metab，1999;84（1）:240-248.
［8］Arici A，MacDonald PC，Casey ML.Progestin regulation of in-terleukin-8mRNA levels and protein synthesis in human en-dometrial stromal cells ［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1996;58（1）:71-76.
［9］Butcher LB，Collins EW，Fugo NW.Plasma concentration of LH，FSH，prolactin，progesteron and estradiol-17（throughout the4-day estrous cycle of the rat ［J］.Endocrinology，1974;94（6）:1704-1708.
［10］Escalada J，Sanchez-Franco F，Velasco B，Cacicedo L.Regula-tion of growth hormone（GH）gene expression and secretion dur-ing pregnancy and lactation in the rat:Role of insulin-like growth factor-I，somatostatin，and GH-releasing hormone ［J］.Endocrinology，1997;138（8）:3435-3443.
［11］Sawada T，Koike K，Kanda Y，Sakamoto Y，Nohara A，Ohmichi bM，Hirota K，Miyake A.In vitro effects of CINC/GRO，a member of the interleukin-8family，on hormone secretion by rat anterior pituitary cells ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1994;202（1）:155-160.
［12］Green VL，Atkin SL，Speirs V，Jeffreys RV，Landolt AM，Mathew B，Hipkin L，White MC.Cytokin expression in human anterior pituitary adenomas ［J］.Clin Endocri，1996;45（2）:179-185.