【关键词】 螺旋蜗轴动脉
关键词: 螺旋蜗轴动脉;P物质;免疫组织化学;豚鼠
摘 要:目的 观察豚鼠螺旋蜗轴动脉（SMA）SP能神经支配的特点. 方法 采用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶-DAB-镍染色技术及免疫透射电镜，探讨P物质（SP）在SMA上的分布特点. 结果 SMA近端外膜上存在着大量SP-IR阳性神经元.在SMA远端外膜上可见大量的SP-IR阳性神经纤维，相互交错，呈网状结构. 结论 SP在耳蜗血管的调节过程中可能起着重要作用.
Keywords:spiral modiolar arteria;substance P;immunohis-tochemistry;guinea pigs
Abstract:AIM To investigate the innervation characteris-tics of SP-immunoreactivity（SP-IR）nerves in the spiral modiolar arteriae of guinea pigs.METHODS Avidin-botin peroxidase complex（ABC）immunostaining combined with the glucose oxidase-diaminobenzidine-nickel（GDN）enhance-ment technique was employed for immunohistochemistry，and the distributions of substance P（SP）under light.RESULTS A large number of SP-IR neurones were found existing in the tunicae adventitia vasorum in the proximal ends of SMA.Meanwhile，a large number of SP-IR nerve fibres showing a net-like appearance were found existing in the tunicae adven-titia vasorum in the distal ends of SMA.CONCLUSION SP might play an important role in the regulation on the cochlear blood flow.
0 引言
已有很多实验证实，耳蜗血管除接受交感神经节后纤维的支配外［1］ ，还受到一些肽类物质的调节［2，3］ .目前从生理的角度来研究影响耳蜗血流因素的报道较多［4-6］ ，但螺旋蜗轴动脉（SMA）肽类神经递质或调质的分布状态尚不清楚.我们采用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶-DAB-镍染色技术及透射电镜，探讨P物质（substance P，SP）在SMA及其分支上的分布特点，为进一步深入研究肽类物质对耳蜗血流的调节作用及其机制，奠定形态学的基础.
1 材料和方法
1.1 材料 兔抗SP抗体（使用效价1 5000，Sigma），生物素标记的猪抗兔IgG和ABC复合物（使用效价1 200，Sigma）;Ⅶ型葡萄糖氧化酶和3，3-四盐酸二胺基联苯胺（DAB）均为美国Sigma公司产品.耳廓反射灵敏，体质量320～380g的健康杂色豚鼠15只，雌雄不拘.戊巴比妥钠（30mg kg-1 ，ip）麻醉后开胸，经主动脉插管灌注固定［7］ .先以生理盐水冲出血液，继之灌以40g L -1 多聚甲醛-0.5mL L-1 戊二醛磷酸缓冲液（PB，0.1mol L-1 ，pH7.4）600～800mL，保留滴注1h.取下颞骨，打开听泡，在解剖显微镜下去除骨性耳蜗，取下蜗轴.在听神经表面剥离螺旋蜗轴动脉.投入40g L -1 多聚甲醛-磷酸缓冲液中再固定12h后，再将标本置于250g L
-l 的蔗糖磷酸缓冲液中（4℃）直至沉底.标本用磷酸缓冲生理盐水（PBS，0.01mol L-1 ，pH7.4）漂洗.
1.2 方法 将螺旋蜗轴动脉按漂洗法置于反应槽内进行免疫组织化学反应.染色程序按照免疫组织化学ABC法，结合葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵增强显色技术进行［8］ .第一抗体孵育时间48h（4℃），第二抗体12h（室温），ABC复合物5h（室温）.每次孵育之间用PBS漂洗（5min，3次）.对照试验用PBS替代第一抗体进行孵育，其余操作与上述一致.血管铺片反应结束后，将螺旋蜗轴动脉从反应槽中取出并置于载玻片上，滴加蒸馏水3～4滴后于解剖显微镜下按原状铺展血管.铺展完毕后放置空气中自然干燥，随后浸入纯乙醇中脱水（10min，2次），转入二甲苯透明后DPX封片.
2 结果
豚鼠SMA经免疫组化染色后，阳性结构明显，界限清楚，背景染色浅淡，所有阴性对照未着色.在SMA近端的外膜层，可见数量较多的SP免疫反应阳性的神经元.多为圆形或椭圆形，直径约30～40μm，含3～5个突起，呈散在分布，并可见由胞体发出的神经纤维（Fig1）.局部放大后，可见SP-IR阳性神经元胞质内含有染色较深的点状颗粒（Fig2）.SMA中段及远端未见SP-IR阳性神经元，但血管外膜SP-IR阳性纤维密集呈网状，相互交错，粗细不均，有明显的交叉和分支，可见膨体（Fig3）.由SMA分出的外上放射状动脉，中放射状动脉以及内上放射状动脉均可见SP-IR阳性的神经纤维.但纤维密度以外上放射状动脉为高. 图1 －图3 略
3 讨论
SP是最早发现的神经肽，广泛分布于中枢及外周神经系统［7-10］ ，在血管系统含量也很丰富.早在1931年，Von Eluer等就已证明SP有血管扩张及刺激平滑肌的作用，并使血管通透性增加，腺体分泌增多［8］ .多数学者认为，这一作用的机制可能是由于逆行刺激感觉神经，使周围C类无髓鞘的感觉神经末梢释放SP所引起
［11］ .SP对耳蜗微血管的作用也为一些实验证实.Vass等［12］ 探讨了辣椒素（capsaicin）对耳蜗血流的作用.发现小脑前下动脉内灌注15～50pmol min -1 的capsaicin，耳蜗血管呈剂量依赖性的扩张;而灌注150～200pmol min-1 或以上的剂量，经1～2min潜伏期后，产生比较稳定的耳蜗血管扩张.但这一作用可被特异性的SP受体拮抗剂［（D- ProZ，D-Trp7.9）-SP］所抑制［13］ .该研究表明，从capsaicin敏感的SP能神经纤维释放的SP，在调控耳蜗血流方面，可能起着重要作用.本研究在豚鼠SMA发现分布广泛的SP-IR阳性纤维，从形态学上证实了SMA受SP-IR阳性纤维的支配.尽管目前对支配SMA的SP-IR阳性纤维是来自感觉神经还是来自副交感神经的节后纤维尚不清楚.但本研究在SMA近端的血管外膜层，发现数量较多的SP-IR阳性的神经元，这些SP-IR阳性神经元可能是一些中间神经元，既接受来自上位神经元的调控，又发出神经纤维支配螺旋蜗轴动脉及其分支，调节耳蜗血流.提示SP在耳蜗血流的局部调节机制中可能起着重要的作用.但是否还存在其他神经肽支配螺旋蜗轴动脉及其分支，还有待进一步研究.
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