【摘要】 辅助生殖技术是我国近十几年来发展起来的一门新技术，是多学科交叉的一个新的领域，涉及妇产科、男科、胚胎学、遗传学、分子生物学等。近年来，由于药物的研发及实验室水平的提高，辅助生殖技术取得了长足的发展，而体外受精-胚胎移植是所有技术得以实施的基础。在此对体外受精-胚胎移植及其衍生技术作一综述。
【关键词】 生殖技术；辅助；不育
广义的辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）包括人工授精（artificial insemination，AI）、体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技术。目前，由IVF-ET及其衍生的新的辅助生殖技术形成人类生殖技术发展的新态势。卵母细胞浆内单精子注射术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)可以帮助许多男性不育患者，甚至是无精子症患者获得生育机会；胚胎着床前遗传学诊断技术（preimplantation genetic diagnosis，PGD）使得许多遗传性疾病在胚胎植入前得以诊断，达到优生的目的；冷冻胚胎和配子复苏技术可以增加一次取卵多次移植的机会，减少移植胚胎的数目，减少多胎妊娠率；囊胚培养技术跨越了胚胎基因激活的阶段，与子宫内膜发育同步，种植率高；细胞核移植技术重建卵子，给卵子储备量少而产生卵子数少的患者带来了福音，但是对重构卵的遗传作用存在争议；人类未成熟卵母细胞体外培养成熟技术（in vitro maturation，IVM）适用于卵子成熟障碍的患者，避免了促性腺药物的副作用，创伤性小，减少医患负担。
1 体外受精-胚胎移植
19世纪末至20世纪中期，是IVF-ET的动物试验阶段，正是这些动物实验奠定了人类IVF-ET成功的基础。1976年，英国的Steptoe等［1］报道了人类首次IVF-ET妊娠，但不幸的是妊娠结局为异位妊娠；随后经过不懈的努力，于1978年获得了Louise Brown的出生。IVF-ET是指在自然周期或刺激周期，于卵泡成熟时将卵子从卵巢中取出，在体外与精子共培养形成胚胎并移植入子宫的一项技术。适用于输卵管性不育、免疫性不育、不明原因性不育等。IVF-ET治疗程序包括：
1.1 控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）与监测卵泡发育 目的是诱导妇女产生同步发育的多个卵泡。COH是IVF-ET的关键，良好的COH方案可以获得高质量的成熟卵母细胞，从而提高受精率和妊娠率。近20年来，COH策略已经发生了许多变化。这些变化涉及到药物的使用，从克罗米芬，到人绝经期促性腺激素（human menopause gonadotropin，HMG），再到高纯度卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和基因重组FSH。在20世纪90年代初，促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）降调节被广泛采用。使用GnRH-a的COH方案可以避免过早的内源性黄体生成素（luteinizing hormone，LH）峰，防止卵泡过早黄素化，提高卵子质量，增加妊娠率。但是同时也增加了促性腺激素（gonadotropin，Gn）的用量，延长治疗周期，未能有效地抑制卵巢过度刺激综合征(ovary hyperstimulation syndrome，OHSS)的发生。近年来，GnRH拮抗剂（GnRH-A）的第三代制剂投入临床使用，GnRH-A的作用特点是：①与垂体GnRH受体竞争性结合；②即时产生抑制效应，降低Gn和性激素水平；③抑制效果剂量依赖性；④保留垂体反应性［2］。由于GnRH-A的作用机制与GnRH-a存在区别，它具有GnRH-a所没有的优点，减少了Gn的用量和用药时间，降低了OHSS的发生率及过早LH峰发生率，但是因为缺乏足够的临床资料验证，GnRH-A的安全性有待进一步研究。生长激素（growth hormone，GH）的使用：对卵巢功能、卵泡生长、类固醇激素的分泌作用是已知的，可能直接作用于卵巢，刺激卵泡生长、卵母细胞的成熟及卵巢雌激素的产生［3］。故往往与Gn联合应用以获得较好的超排卵反应，增加可移植胚胎的数目。
1.2 取卵 于注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）后的36 h左右，卵泡成熟但未破裂时，抽取卵泡液找出卵母细胞。在IVF-ET的应用初期曾采取腹部切口或腹腔镜进行取卵手术，现在基本已被B超引导下经阴道穿刺取卵所替代。
1.3 体外受精-胚胎移植 将取出的卵母细胞放入培养液中培养，使卵子进一步成熟，并与经过处理的精子混合受精培养。镜下观察到受精后，继续培养至细胞分裂至4~8个细胞时将胚胎移植入母体子宫内。
1.4 黄体支持 应用黄体酮或者HCG支持至妊娠3个月。IVF-ET在临床上已经应用了20余年，有足够的资料证实其安全性，Anthony等［4］对4224例IVF-ET和314605例自然受孕的先天畸形率作对比，结果无明显差异。Hahn等［5］对IVF子代进行调查，认为其行为、精神神经、运动、社会适应等方面与自然受孕儿无差异。
2 卵母细胞浆内单精子注射术
2.1 适应证 ICSI技术是帮助精子直接穿过卵母细胞而发生受精，使那些曾经被认为丧失生育功能的夫妇获得自己的后代。近年来被成功应用于男性不育症的治疗。ICSI的主要适应证是：精液中前向运动精子＜1×109/L；未成熟精子，如取自睾丸或附睾的精子，常规IVF反复受精失败，不明原因不孕，卵子冷冻后受精等。
2.2 ICSI的安全性 1992年，Palermo等［6］将ICSI技术应用于临床并获得成功，成为辅助生殖技术发展的里程碑。随后相继出现附睾、睾丸精子甚至睾丸精细胞ICSI治疗技术，使得无精子症不育的治疗有了新的突破。ICSI技术治疗的有效性是肯定的，Tourmaye［7］进行了一项针对男性为中等程度的少弱精子症不育夫妇的实验：用同一批卵子随机采用IVF和ICSI，发现ICSI受精率比IVF高3.9倍。但是，因为ICSI所使用的精子越过了自然受精的屏障，并且在操作中可能损伤到细胞骨架或减数分裂中的纺锤体，它的安全性受到普遍关注。Causi等［8］针对2949例ICSI和10785例IVF临床妊娠结局分析，表明ICSI未增加妊娠失败或出生缺陷的概率。Bonduelle等［9］也报道ICSI后出生缺陷与一般人群的发病率相似。但是，这些证据并不能否定ICSI存在一定的遗传风险。
2.3 ICSI潜在的风险
2.3.1 使用遗传异常精子的风险 ①染色体异常。②囊性纤维化跨膜传导调节基因(CFTR)突变：先天性双侧输精管缺失的不育症患者有75%~80%至少可以检测出一个CFTR突变［10］。③Y染色体的微缺失：Y染色体长臂的无精子因子（azoospermia factor，AZF）分为3个功能区：AZFa、AZFb、AZFc。其中AZFa缺失常与精原细胞完全缺失有关；AZFb缺失通常与生殖细胞成熟停滞有关；AZFc缺失较常见，与多种无精子和严重少弱精子症有关。在存在AZF缺失的情况下进行ICSI治疗，会将AZF缺失遗传给男性子代，故应该考虑通过PGD进行性别选择。④雄激素受体（AR）基因三核苷酸重复：AR基因CAG片断的重复在ICSI应用过程中可以被遗传甚至于被扩增。过度扩增的CAG重复序列增加神经元变性疾病的发病风险，如延髓脊髓性肌萎缩超过50%表现为严重少弱精子症或无精症导致不育。
2.3.2 精子线粒体DNA(mtDNA)遗传风险 mtDNA突变率较高，可以引起人类精子功能障碍。但目前还没有证据表明ICSI会增加父亲mtDNA传递导致mtDNA疾病的风险［11］。
2.3.3 显微注射过程中以及外源性物质导入卵子的风险 如聚乙烯一氯五环酮（PVP）液、病原体等。
2.3.4 机械损害的风险 损伤细胞骨架或减数分裂中的纺锤体。
2.3.5 印迹基因改变的风险 Lucifero等［12］报道ICSI技术有可能干扰卵母细胞或早期胚胎中母系基因印迹的建立和维持。故为了减少ICSI的遗传风险，应进行严格的遗传学检测。
3 胚胎着床前遗传学
诊断技术PGD是辅助生殖技术与分子生物学技术相结合发展的产前诊断技术。通过显微操作获得来自卵裂球、囊胚或者胚泡滋养外胚层的单细胞，应用PCR和FISH技术进行遗传学诊断。PGD主要应用于性连锁隐性遗传病、单基因疾病、染色体数目与结构异常及与高龄相关的非整倍体检测等，以减少畸形胎儿的发生率。1990年，Handyside等［13］报道第1例植入前性别诊断婴儿出生。发展至今，应用FISH技术行PGD可针对性连锁遗传、胚胎非整倍体的筛选、染色体结构异常等做出诊断。Abdelhadi等［14］报道用适宜的探针与要求进行PGD监测染色体非整倍体的患者的活检细胞经历3个连续的荧光原位杂交过程，可同时检测13对染色体的异常。Munne［15］报道经PGD检测后的妊娠自发流产率从23%降至11%。理论上讲，只要有足够的序列信息，PGD能够针对任何遗传条件进行分析，即凡是能够被诊断的遗传病都可以通过PGD来防止患儿出生。但是，目前PGD在技术上尚存在难点，其细胞遗传学分析诊断的准确率和可靠性尚难达到100%。目前，PGD取材的主要来源有三：极体、卵裂球或滋养层细胞的活检以及单个或数个细胞。卵裂球活检是目前常用的方法，这种方法的缺点是卵裂阶段的胚胎嵌合体的发生率很高，卵裂阶段单个卵裂球的检测结果并不能代表整个胚胎的状态，可能造成误诊或者漏诊［16］。囊胚是胚胎进行活检的最后阶段，囊胚期滋养细胞可以获得充足的样本量，提高PGD的准确性。但是，胚胎必须在受精后5~6天移植，使得诊断时间受到严格限制。极体活检的优点是不影响卵子的正常发育与受精，而且取材较早，有更多的时间分析；缺点是不能分析父源性染色体异常。已经有学者应用极体和卵裂球胚胎联合活检进行PGD，提高诊断率［17］。目前尚无足够的资料证明PGD对子代安全性的影响，但在优生优育方面蕴含着巨大的潜力。随着人类对疾病基因认识的深化及诊断技术的提高，将某些遗传病从人群中筛选出来的希望仍然存在。
4 冷冻技术
在生殖领域中，冷冻技术应用广泛，包括：精子冷冻、胚胎冻存、成熟卵子冻存、幼稚卵细胞及卵巢组织冻存等。冻融胚胎移植的临床意义：冷冻胚胎和配子复苏技术可以增加一次取卵多次移植的机会，减少移植胚胎的数目，减少多胎妊娠率；在治疗中出现严重的OHSS时，可以推迟移植时间；发生治疗意外时，如移植困难等。冻融胚胎移植周期的妊娠率虽然低于新鲜移植周期，但累计妊娠率增加。尤其现在对移植胚胎的数目的限制及单胚胎移植的趋势，使得冷冻技术有了更大的潜力。胚胎冻存可在原核期、卵裂早期和囊胚期进行。胚胎冷冻的方法有程序冷冻、超快速冻融法和玻璃化法等。目前大多数采用玻璃化法技术。1986年，Chen［18］首次报道了人类卵子冷冻经体外受精后获得妊娠。卵母细胞的冻存处于排卵时，卵母细胞处于减数分裂的中期Ⅱ，含有23条染色体，每个染色体有2条染色单体组成，排列在赤道面上，与减数分裂纺锤体的微管相连，这个时期的结构对温度极为敏感，故卵母细胞的冻存难题至今尚未攻克。而未成熟卵母细胞具有相对静止、体积小、缺乏透明带及皮质颗粒的特性，比成熟卵子更易耐受冷冻和复苏过程中所造成的损伤。近年来，随着IVM技术的发展，已经可以采用幼稚的卵细胞甚至卵巢组织薄片冻存。
5 囊胚培养技术
囊胚期胚胎经过了人类胚胎发育阻滞阶段（8细胞期）的筛选，可以获得最具有活力的胚胎进行移植；囊胚期移植更符合生理状况，有利于增加子宫内膜与胚胎发育的同步性［19］；为PGD的实施提供了时间，使得胚胎在活检后有更长的时间恢复再进行移植［20］。囊胚期胚胎培养的发展经历了3个阶段：单一培养、共培养和序贯培养。近年来，序贯培养已经基本取代了前两者。1998年，Gardner等［21］在哺乳类胚胎生理学基础上，根据人类生殖道液糖类的含量和胚胎进入宫腔时宫腔液的成分，设计配置了不含血清的G1、G2序贯培养液，新近又推出G3系列培养基，培养时间可以延长至5天，使得胚胎在体外发育至囊胚期成为现实。囊胚移植的适宜人群尚无定论，目前临床上将第3天8细胞胚胎数目作为决定的一个关键条件。第3天8细胞胚胎数＜3个在第3天移植，≥3个可继续培养至第5天移植。Racowsky等［22］经过回顾性分析发现，第3天8细胞胚胎数≥3者第5天移植较第3天移植的妊娠率明显提高，第3天8细胞胚胎数＜3者第5天移植较第3天移植妊娠率无明显差异。研究证明，选用高质量的囊胚移植不但显著提高胚胎着床率，还可以减少多胎妊娠发生的风险［23］。随着人们对胚胎发育认识的不断深入及实验室技术的不断发展，囊胚期移植的优势导致它有可能会取代现行的胚胎培养体系成为IVF治疗的常规方法。
细胞核移植技术是近几年来发展起来的新技术，为卵子的重建提供了新的方法。女性到37~38岁，卵母细胞减少的速度增快，不仅卵母细胞存储数量减少，而且质量也随着年龄的增长而下降。目前没有办法能够修复或挽救这些卵子。设想它的部分细胞结构能被正常卵子所替代，可提高卵子质量。途径之一是胞质置换，但是这种胞质置换发生在成熟卵子，并不能解除减数分裂过程中可能发生的染色体失衡。这一问题可通过转移生发泡（GV）期卵子核到一去核年轻妇女的未成熟卵子内来解决，即核移植。然后通过体外培养使这些卵子成熟，以排出第一极体作为核成熟的标志。核移植技术的应用，将会使制造卵子成为可能，给那些由于卵子储备量少而产生卵子数少的患者带来福音。但是，因为线粒体具备一种特性——拥有独立于核DNA的线粒体DNA（mtDNA）、Barritt等［24］报道移植后供者的mtDNA持续存在；大部分学者对这项技术持谨慎态度：胞质内含有遗传物质，重构卵的遗传物质已经发生变化！
7 人类未成熟卵母细胞体外培养
成熟技术自1991年Cha等［25］从因为良性病变而被切除的卵巢中获取不成熟卵母细胞，在体外培养成熟并成功妊娠以来，IVM技术无论在实验室还是临床方面的研究都取得了一定的进展。2004年Chain等［26］报道世界上已有300多例采用IVM技术妊娠的婴儿分娩。IVM技术主要是针对一些卵子成熟障碍的不育症患者，尤其是对于多囊卵巢综合征（PCOS）无排卵者已经有较多的研究并获得了较高的临床妊娠率(25%)［27］。IVM技术是指在不经过超促排卵或少量应用促性腺激素后从卵巢中获取未成熟卵，在体外经过适宜的条件进行体外成熟培养，使卵母细胞成熟并具有受精能力。在IVM过程中，培养环境对卵母细胞的成熟至关重要，在培养系统添加促性腺激素、表皮生长因子、葡萄糖和丙酮酸、卵泡液等有助于卵子成熟，另外，卵泡的直径大小、取卵时间、年龄等因素也会影响卵母细胞的成熟。IVM尽管取得了很大的进步，但仍然存在许多问题和不足：卵子成熟率低、成熟后卵子受精率低、种植率低、IVM卵子质量不能保证。经IVM妊娠分娩的子代尚缺乏足够的临床资料验证其安全性。但是，IVM具有显而易见的临床意义，在于：与IVF/ ICSI技术结合治疗多囊卵巢综合征即卵巢发育不良等疾病；避免患者接受超促排卵导致的卵巢过度刺激综合征的发生；节省医疗费用和就医时间；解决卵巢组织冷冻保存后卵细胞的成熟问题及未成熟卵冷冻保存后的应用问题，将会对癌症患者在化疗或者放疗之前拯救其遗传物质，为高龄妇女建立卵母细胞库具有重大意义；为卵母细胞成熟机制的研究建立体外模式。由此可见，IVM技术的研究对治疗人类不育、推动辅助生殖技术的发展有着深远的影响。经过近20年的发展，我国的辅助生殖技术已经取得了惊人的进步，许多新技术对不育症的治疗产生了很大的作用。在掌握社会和医学伦理以及本领域相关规范的保障下，相信辅助生殖技术会得到健康可持续发展。
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