关于人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达

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　　　　　　 作者：姜立 马文丽 柯杰兵 彭翼飞 李晋 徐兵 郑文岭

【摘要】 目的 构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶（OAZ）突变基因，重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。方法 采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位碱基T碱基缺失，使核糖体的阅读框+1移位，连续表达OAZ基因的ORF2部分。测序鉴定后，重组质粒转化BL21菌，进行突变基因的蛋白表达。结果 重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失，其余碱基序列无变化。重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ全长蛋白，SDS-PAGE分析在相对分子质量45 900左右出现新的蛋白条带。结论 成功构建人OAZ突变基因重组质粒，转化BL21后表达出融合的OAZ全长蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。
【关键词】 鸟氨酸脱羧酶抗；突变；蛋白表达
鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的关键酶，催化多聚胺生物合成途径中的第一步——鸟氨酸向腐胺的转变。随后，腐胺再转变为亚精胺、精胺。ODC是该代谢途径的限速酶，在此过程中扮演着重要的调控酶角色，其活性可在转录、翻译和翻译后水平受到精确的调控。鸟氨酸脱羧酶抗酶（ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）是在翻译后水平的一种调控形式，它可以连接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，从而负性调控细胞内多聚胺含量。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达在降低细胞内多胺水平的同时还能抑制细胞的生长。由此推测，OAZ在细胞的生长与分化过程中担任着重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表达有一个非常有趣的移位翻译现象，其表达受到精胺的一个称之为frame-shifting的核糖体移位的调控。多聚胺通过这种较罕见的调控机制诱导OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在细胞内的浓度，使细胞在一个稳定的多聚胺水平进行正常生长分化。OAZ转录本的编码存在两个不同的阅读框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其实是一个由短的非保守的ORF1产物和高度保守的ORF2产物的组合。在OAZ mRNA的阅读框中，需要有一个+1的翻译移码过程。在ORF1的5′端终止密码子处，通常序列为TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻译框架达到TGA时，如果没有精胺的存在，核糖体将接受TGA为终止密码子，翻译到此终止。当精胺浓度一定时，核糖体的翻译即可受到精胺的调控进行+1移码，跃过终止密码子TGA上的T，以GAT指导的天冬氨酸为后续，翻译合成ORF2［4-5］。翻译框架移码受到细胞内多聚胺水平上升的正调控，表达出的OAZ蛋白又能调节ODC的酶活性，反向调节细胞内多聚胺的水平，从而影响到细胞的生长及分化。在生长旺盛的肿瘤组织中，普遍发现了ODC的高表达，因此，OAZ蛋白特有的调控ODC活性的功能，就使之成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表达受到精胺的诱导，缺乏精胺时，核糖体将不能进行+1的移位，翻译完整的全长OAZ蛋白。为此，本研究对OAZ基因进行了特定T碱基的缺失突变，成功构建至表达载体pET-32a中，测序确认后命名为pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表达出OAZ全长蛋白，将对进一步研究该基因的功能以及以OAZ为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备，具有重要意义。
　　1 材料和方法
　　1.1 试剂 大肠杆菌DH5α、BL21和表达质粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild质粒由本实验室保存。QuikChange定点突变试剂盒购自Stratagene公司。质粒纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶均购自TaKaRa公司，其余生化试剂均为国产分析纯。 引物根据OAZ基因所需点缺失碱基处进行设计2条反向互补引物对P1与P2。 P1：5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′；P2：5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。
　　1.2 方法
　　1.2.1 反向PCR扩增 以pET-32a-OAZ-wild质粒为模板进行PCR 反应: 将pET-32a-OAZ-wild质粒(10 mg/L) 1 μl、dNTP 1 μl、10×Buffer 5 μl、P1与P2 引物 ( 100 mg/L)各2.5 μl、PfuTurbo DNA多聚酶(2.5 ×106 U/L) 1 μl、双蒸馏水37 μl 加入PCR 管; 95℃预变性30 s后， 95℃ 30 s、55℃ 1 min、68℃ 6 min ，共 18个循环。PCR 产物置于冰上2 min ， 加入1.5 μl DpnⅠ内切酶(106 U/L)， 37 ℃水浴2 h，酶解模板DNA。
　　1.2.2 转化大肠杆菌DH5α 取感受态大肠杆菌50 μl， 加入上述DpnⅠ处理液10 μl， 轻轻混匀， 冰浴30 min →42℃热休克45 s →冰上2 min，加入预热的LB 培养液0.5 ml， 置于37℃恒温摇床中， 200 r/min 振摇1 h。
　　1.2.3 质粒扩增、提取及鉴定 取200 μl 菌液铺到LB 琼脂培养板( 含Amp) 上， 37℃培养12～16 h。挑取单菌落，提取质粒。取质粒5 μl， 选取插入片段两端的酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ 双酶切，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶进行分析鉴定。含目的基因的质粒经测序验证目标碱基缺失后，命名为pET-32a-OAZ-mutation。
　　1.2.4 重组蛋白表达 将含有pET-32a-OAZ-mutation的质粒转化BL21菌，铺板挑阳性菌落并酶切鉴定为阳性菌落后，接种至含5 ml LB培养基中（含氨苄青霉素）振培过夜。次晨取100 μl接种至新的5 ml LB培养基中，37℃振培3～4 h，至D值约为0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mmol/L，继续培养2 h和4 h后取菌液1 ml，进行15%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物，以转染空pET-32a质粒的BL21菌在同等条件下用IPTG诱导为阴性对照。
　　2 结 果
　　2.1 pET-32a-OAZ-mutation测序图 PCR扩增后，DpnⅠ酶切产物并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，鉴定含有目的基因后，抽提质粒，以T7启动子序列为测序引物序列于ABI3730测序仪进行DNA序列测定，确定OAZ基因的TGCTCCTGATGCC(196~208)处的202位T已缺失，其余序列没有变化(测序图中的第312~323号序列为TGCTCC GATGCC，显示T已缺失)。见图1。
　　2.2 重组pET-32a-OAZ-mutation在BL21宿主菌中的蛋白表达 SDS-PAGE分析结果显示，经IPTG诱导的含重组质粒BL21与对照菌相比，在相对分子质量为45 900位置上出现1条新带。见图2。图1 T7启动子测序结果图
　　图2 表达产物SDS-PAGE图
　　MMarker；1BL21菌；2转化pET-32a质粒的BL21菌；3转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后2 h；4转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后4 h
　　3 讨 论
　　细胞的生命活动需要多聚胺(polyamine)类物质，包括腐胺(putrescine)、亚精胺(spermidine)和精胺(spermine)。多聚胺几乎是所有活细胞的必要组分，它们的缺失将导致细胞生长减少甚至死亡，但是当它们的含量升高时也会有致癌作用并且可以诱导细胞凋亡［6-7］。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达除了能降低细胞内多胺水平，还能抑制细胞的生长。而OAZ能够特异地拮抗ODC的催化活性，减少细胞内多胺的生成，因此成为研究抑制肿瘤细胞恶性增殖的切入点［8］。

从最初哺乳类动物细胞中克隆出OAZ基因至今，已陆续发现有OAZ1、OAZ2和精子特异性的OAZ3基因。其中OAZ1，也就是通常所说的OAZ基因，其表达的蛋白产物对于ODC有特异性的拮抗作用。OAZ的的抑制作用不是直接降解ODC，而是OAZ与ODC结合后，通过26S蛋白酶降解ODC，是一种在翻译后水平调节酶活性的机制。ODC是一个二聚体酶，亚基间的聚合与解聚非常迅速。OAZ对于ODC单体蛋白有非常高的亲和力，形成AZ∶ODC的蛋白聚合体，促进ODC被26S蛋白酶降解［7～11］。人OAZ蛋白是由两段ORF的表达框所翻译表达，在第一个表达框的终止密码子处，有一个核糖体移位位点，在精胺诱导下，出现程序性的阅读框的移位。越过终止密码子，继续住下游翻译，直至第2个表达框的终止密码子处。全部蛋白共由228个氨基酸所组成，其中ORF1编码N末端68个氨基酸，ORF2编码C末端160个氨基酸。ORF2编码的C末端氨基酸序列是真正发挥抗酶活性的肽链区段，但是该区段的蛋白表达需要在精胺的诱导下才能出现，因此增加了对于OAZ全长蛋白调控机制的研究难度。
　　故此，本研究通过定点突变技术，成功地使OAZ基因ORF1与ORF2间的核糖体移位位点发生缺失，也就是使ORF1的终止密码子的TCCTGATGCC的T发生缺失，使核糖体按照随后GAT GCC的三联体顺序进行翻译，无需精胺的诱导即可表达出完整的OAZ蛋白。由于选用质粒pET-32a作为原核表达载体，OAZ蛋白表达的同时，还在其C末端携带有多聚组氨酸的标签，可通过His标签蛋白进行纯化，为进一步研究其在肿瘤细胞中的调控机制提供了条件，为开发其临床应用奠定了基础。

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