作者：尹晓慧 齐素华 许静 韩东 张光毅
【摘要】 目的 研究PTEN抑制剂pic与脑缺血诱导的海马CA1区神经元损伤及复灌过程中Akt1活化变化的关系，来揭示pic保护缺血神经元的机制，从而为更清楚地了解缺血性神经元损伤的机制提供新的依据。方法 实验分为空白对照组、缺血对照组、溶剂对照组及pic组。通过四动脉结扎建立大鼠全脑缺血模型，在缺血前腹腔注射溶剂或PTEN的特异性抑制剂pic。采用免疫印迹方法检测大鼠海马中Akt1活化情况的变化。通过焦油紫染色观察海马神经元的存活情况。结果 给予pic后，海马神经元中Akt1活化程度较对照组明显升高（n=3），同时海马CA1区存活神经元也较对照组明显增加（n=5）。结论 pic通过抑制PTEN而激活Akt1，从而保护缺血神经元。
【关键词】 脑缺血 PTEN pic Akt1
多年来对于Akt的大量研究表明，Akt是一种与细胞生长、存活相关的蛋白。生长因子受体的活化能够激活PI3K/Akt信号通路。我们实验室过去的研究显示，具有神经元保护作用的预缺血处理也能激活PI3K/Akt信号通路［1］。Akt是一种蛋白激酶，它通过磷酸化其下游底物而传递细胞信号。其直接的上游激活蛋白并不是PI3K，而是另外一些蛋白，比如PDK。这些蛋白磷酸化Akt的308位酪氨酸或473位丝氨酸而将其激活［2~4］。Akt的激活除了需要PDK等，还必须有一种非蛋白物质的参与，那就是PIP3。而PIP3则是位于细胞膜内侧的PIP2在PI3K的磷酸化作用下生成的［5-6］。PI3K/Akt信号通路本身是一个促进细胞生长、存活、分化的信号通路，但同时它还影响着其他的信号通路。在缺血耐受的研究中发现，PI3K/Akt信号通路介导了缺血耐受中MLK3/JNK信号通路的抑制［1］。
MLK3/JNK信号通路是介导缺血性神经元损伤的重要信号通路，这一观点目前已得到公认。作为MAPK信号通路的上游蛋白，MLK3可以被Akt磷酸化而负性调节，因此，Akt能够通过抑制MLK3/JNK信号通路而介导预缺血的神经元保护作用［7-8］。
1997年，科学家们发现了一种新的蛋白PTEN。虽然对于它的研究时间并不长，但是它的重要生物学作用早已引起了广泛关注。首先，PTEN是一种抑癌因子，它通过负性调节Akt来介导肿瘤抑制作用［9-10］。而我们这里不想讨论它的抑癌机制，我们关心的是它的2种磷酸酶活性，即磷脂酶和蛋白磷酸酶活性。PIP2在PI3K的磷酸化作用下生成PIP3，从而介导Akt的活化［5-6］。PTEN却可以发挥它的磷脂酶活性使PIP3脱磷酸，这样PTEN就抑制了PI3K/Akt信号通路［9］。PTEN的蛋白磷酸酶活性则可以以Shc为底物［11］。Shc是MAPK信号通路活化的重要信号分子。因此PTEN可以直接抑制MAPK信号通路。
pic是PTEN的抑制剂，目前已被广泛地应用于科学研究。这里我们是想通过研究pic对缺血复灌中Akt1活化的影响来揭示pic保护缺血神经元的机制。
1 材料和方法
1.1 SD大鼠脑缺血/再灌注模型的建立 按本室已建立的大鼠四动脉结扎模型，实验动物随机分为空白对照组、缺血对照组、溶剂对照组和pic组。动物以20%水合氯醛（300~350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第3天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15 min，然后再灌注10 min或5天。以缺血动物体征及表现判断缺血模型的可靠性。空白对照组处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。
1.2 给药 pic溶于生理盐水（0.25 g/L），以1 mg/kg的剂量分5次于手术后第2天腹腔注射，每次间隔2 h，1天内注射完。以相同体积的生理盐水腹腔注射作为阴性对照。
1.3 样品制备 大鼠缺血/再灌注后，断头快速取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加匀浆缓冲液，用Glas－col匀浆器高速匀浆（10 s×6次），4℃下800 g离心15 min，小心移取上清液（主要为海马的胞质部分）。
1.4 蛋白含量测定 按Lowry等方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
1.5 免疫印迹 等量蛋白样品经10%SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以湿转或半干转法电转移至醋酸纤维素膜（NC膜）上。转移后的NC膜经3%牛血清白蛋白封闭后加入不同浓度的稀释后的一抗，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗（羊抗兔IgG-AP 或羊抗鼠IgG-AP），37℃反应2 h，洗膜。以NBT/BCIP显色，结果以Image图像分析软件处理。
1.6 组织学检查方法 于复灌第5天，以水合氯醛麻醉大鼠。接着以生理盐水和4％多聚甲醛行心室灌注。取脑放于4℃同样的多聚甲醛中后固定1天以上。然后将脑块放于梯度乙醇溶液中脱水并于二甲苯中透明。包蜡后的脑块切片（5 μm厚），经脱蜡，脱二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。
1.7 统计学处理 数据以x±s表示，统计分析采用方差分析（ANOVA），组间比较采用Sigma Stat统计软件处理，P&<0.05为统计学差异有显著性。
2 结 果
2.1 pic对缺血后神经元有显著保护作用 为了更明确揭示PTEN是否介导了缺血性神经元损伤，我们应用焦油紫对大鼠脑切片进行染色，来检测神经元的存活情况。结果显示，与空白对照组相比，缺血对照组及溶剂对照组的存活神经元分别为（10.2±1.4）％和（8.9±2.7）％；而pic组存活细胞增加至（45.0±3.2)%（n=5，P&<0.05）。见图1。
2.2 pic 显著增强了Akt1的活化 如前面所述，Akt是一种保护性蛋白，它介导的信号通路与细胞的存活、生长有关。而Akt活化所必需的PIP3则受PTEN的负性调节。所以这里，我们通过检测给予PTEN的抑制剂pic后，海马神经元内Akt1的磷酸化水平来反映PTEN在缺血性神经元损伤中所发挥的作用。结果如图1所示，与空白对照组相比，缺血对照组及溶剂对照组大鼠海马神经元内Akt1的磷酸化水平没有明显的变化。pic组与各对照组相比却表现出了Akt1磷酸化水平的显著增高（n=3，P&<0.05）。各组间Akt1表达水平没有明显变化。见图2。
缺血性疾病，例如脑缺血、心肌缺血、胃缺血，是一类发病率很高的疾病，严重地危害着人类的健康。因此，明确其发病机制，寻求其预防和治疗的方法已成为一项重要而艰巨的任务。对于脑缺血性疾病的研究已取得很大的进展。其中，MAPK信号通路在介导缺血性神经元损伤中发挥的作用已比较明确。MAPK信号通路是一条蛋白激酶级联反应信号通路。其上游以MLK3为代表的MAPKKK通过磷酸化反应激活其下游的多种蛋白激酶，继而产生一系列生物学效应，介导神经元损伤。然而，细胞内的信号通路并不是一条一条相互独立的，它们通过信号分子之间的相互作用而交织成复杂的网络。比如，Akt是一种保护性蛋白激酶，它通过磷酸化反应激活其下游蛋白，从而产生一系列与细胞生长、存活有关的生物学效应。除此之外，Akt还能够磷酸化MLK3的674位苏氨酸。这一磷酸化反应是对MLK3活性的负性调节，抑制了MAPK信号通路，与Akt的保护性作用是一致的［7-8］。在神经元的缺血耐受中，Akt1就是通过这样的方式介导了预缺血的神经元保护作用［1］。
损伤性信号与保护性信号在细胞内同时存在而且相互作用。有研究结果显示，缺血/再灌注12 h胞内Akt1的活化水平有明显升高［1］。但是由于这时损伤性信号更强，所以缺血复灌最终表现为神经元的损伤。而在缺血前给予PTEN的抑制剂pic，复灌10 min时本来很低的Akt1活化水平则明显升高。同时，海马神经元存活量也明显增加。由此我们推论，在缺血/再灌注时PTEN抑制了保护性信号通路PI3K/Akt1，从而介导了缺血性神经元损伤。而pic则是通过抑制PTEN而激活Akt1，从而保护缺血神经元。
对于PTEN这一信号蛋白在缺血性神经元损伤中的作用还有大量工作要做，期望能从中获得预防和治疗中风的更好方法。
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