作者：秦迎松 庞训雷 于红丽
【摘要】 目的 研究组胺对荷黑色素瘤C57BL/6小鼠各器官及肿瘤微血管壁通透性的影响，为通过组胺增加抗体靶向药物在肿瘤局部的富集提供依据。方法 细胞悬液接种法制备荷瘤模型，伊文思蓝法检测各器官及肿瘤微血管壁通透性，组织化学方法观察组织结构改变。结果 ①成功建立荷瘤模型，成瘤率100％。②对照组伊文思蓝（Evans blue， EB）在各器官分布达平衡的过程不同：肝、肺存在明显再分配；小肠、脾和肿瘤组织中EB随时间不断积累，在高水平上保持平衡；心、肾中EB含量随时间的积累过程比较缓慢，升高幅度不显著；脑组织中EB含量极少。③组胺组分布达平衡前各组织中EB含量与对照组相应时间点相比变化较大，平衡后小肠、脾、肺(P&<0.05)及肿瘤(P&<0.01)组织中EB含量比对照组升高，其他器官的改变无统计学差异。④组胺组各器官组织均未见明显水肿、出血表现，而瘤体内微血管明显扩张充血，新生血管中血浆成分渗出增加，瘤内及被膜下出血常见。结论 组胺能够增加EB在肿瘤局部的富集，适度组胺负荷不会给机体造成明显伤害。
【关键词】 组胺 黑色素瘤 血管壁 通透性
Abstract： Objective By investigating the effect of histamine on the microvessel permeability in melanoma B16 burdened C57BL/6 mice to provide an experimental rationale for the use of histamine in the antibody-coupled anti-tumor therapy. Methods Cultured melanoma B16 cells were collected， adjusted to 1×1010/L and inoculated into the left armpit of C57BL/6 mice (200 μl each). Model mice were pided into two groups: the test group was injected 1.5% Evans blue (EB) 2 ml/kg through the caudal vein， followed by histamine 300 mg/kg hypo. The control group was injected EB only. At the time points of 10 min， 30 min， 1 h， 2 h and 4 h after injection， the mice were sacrificed to determine the optic density of EB in internal organs and tumor tissue with spectrophotometer at 620 nm. The structural changes were examined using histochemical stain. Results ① The formation of melanoma model in mice was 100% successful. ②The distribution of EB varied in different organs in the control mice: redistribution was noticed in the liver and lungs， being increased at first， and then declined; higher accumulation of EB was found in the jejunum， spleen and tumor; slow and less accumulation of EB， in the heart and kidneys; few EB in the brain. ③Histamine changed the distribution pattern of EB in the test group， causing apparent plasma level fluctuation. After equilibration， the EB level was apparently increased in the jejunum， spleen and lungs (P&<0.05) and in the tumor (P&<0.01)， but not in the brain. ④ No apparent edema or hemorrhage could be seen in the internal organs in the histamine-treated model mice; but in the tumor，apparent microvessel congestion， increased plasma exudation， and bleeding within the tumor or under the pseudo-capsule were often seen. Conclusion Histamine increases the accumulation of EB in most tissues of the melanoma B16 burdened C57BL/6 mice， especially in the tumor tissue， causing no apparent injuries to the body， if histamine is not overloaded.
Key words: histamine; melanoma; vessel wall; permeability
肿瘤是危害人类健康的三大疾病之一。常规的术后放、化疗各有其局限性。近年来开发的肿瘤靶向给药系统，如抗体－药物偶联物等，因其具有定向在肿瘤局部富集、特异杀伤肿瘤细胞的优势，成为目前肿瘤治疗领域研究的热点。但是，血管壁的通透性却构成这些大分子药物进入瘤体的主要屏障。虽然许多实验证明肿瘤组织中微血管壁的通透性较正常组织微血管壁的通透性高，但抗体偶联物到达肿瘤组织的药量仍十分有限。据推算，肿瘤组织的单抗摄取量仅为0.005％（注入剂量/g）［1］。因此，血管壁的通透性构成了大分子载体药物进入瘤体的主要屏障。增加微血管壁通透性可以使靶向药物有更多的概率与肿瘤细胞接触并在局部富集，从而增强其疗效。
组胺是一种具有生理活性的小分子胺，在炎症反应中能促使血管平滑肌收缩、微血管壁通透性增加，使大量的炎性细胞和抗体等生物活性物质聚集于炎症局部，发挥作用。外源性组胺还具有抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤组织退行性变、增加淋巴细胞在瘤体内的渗透等作用。
本实验的目的，即观察外源性组胺对荷瘤小鼠微血管壁通透性的影响，为组胺辅助于临床抗肿瘤治疗提供依据。B16黑色素瘤起源于C57BL/6小鼠，该模型既能够更好地模拟人体荷瘤的实际情况，又可避免因异体接种排斥反应导致组织水肿，影响实验的观察。
1 材料和方法
1.1 实验材料 组胺、伊文思蓝（Evans blue，EB），购自上海化学试剂采购供应站，胰蛋白酶、RPMI-1640细胞培养基购自上海普飞生物技术有限公司，B16黑色素瘤细胞购自上海午立生物技术有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，C57BL/6小鼠由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠荷瘤模型的建立 C57BL/6小鼠，6~8周龄，雌雄不限。采用细胞悬液接种方法。收集培养的小鼠B16黑色素瘤细胞，调整细胞密度至1×1010/L，按200 μl/只的量，接种于小鼠左前肢腋部皮下，15天后进行微血管壁通透性实验。
1.2.2 微血管壁通透性实验 将所有荷瘤小鼠随机分为2组，对照组尾静脉注射1.5%EB，20 ml/kg，于注射后10 min、30 min、1 h、2 h和4 h取心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、肿瘤等各组织，称重后剪成小碎块，分别置于2 ml甲酰胺中室温浸泡48 h，离心，上清液于721分光光度计620 nm处比色，计算各种组织单位质量下的光密度值（D值）。实验组首先尾静脉注射1.5% EB溶液，剂量同上，随即背部皮下注射组胺，300 mg/kg，于上述各时间点取材，比色，并计算各组织单位质量下的D值。
1.2.3 组织学观察 取不同时间点的各组织，常规制备石蜡切片，苏木精-伊红染色，观察组胺对微血管壁通透性的影响。
1.3 统计学处理 应用SPSS 11.0统计学软件，采用两独立样本的t检验方法进行组间差异的统计学分析，P&<0.05为具有统计学差异。
2 结 果
2.1 C57BL/6小鼠荷瘤模型的建立 B16黑色素瘤细胞培养至对数中期后，如上述方法接种于C57BL/6小鼠左前肢腋下。成瘤率100％，未见明显排斥反应。
2.2 微血管壁通透性实验 各组动物于给药后不同时间取材，测量并计算单位质量组织中EB的D值，结果如图1所示。组胺皮下注射能够明显改变EB在荷黑色素瘤C57BL/6小鼠体内各组织中的分布过程，提高其在肿瘤(P&<0.01)及脾、肺、小肠(P&<0.05)中的含量。此作用可能与组胺扩张血管引起的血流动力学改变有关。
EB在肝、肺中存在明显的再分配过程，随尾静脉的不断吸收而增加，随其在其他器官的不断积累而下降，然后逐渐达到平衡。小肠、脾、肿瘤组织中EB的分布过程类似，随时间进程不断积累，然后在高水平上保持平衡。心、肾中EB含量随时间的积累过程比较缓慢，升高的幅度亦不显著。脑组织中EB含量极少，随时间变化亦不明显。如图2。
组胺皮下注射后：①EB在各组织中的初始含量(10 min)与对照组不同，脾、肺中增高，心、肝、肾中降低，小肠、脑、肿瘤组织中无明显变化；②从各器官分布的动态过程看，EB在肝、肺中的分布过程类似，在小肠、脾和肿瘤组织中分布过程的后期类似；③分布达平衡后，EB在小肠、脾、肺及肿瘤组织中的含量明显提高。见图3。
分布达平衡后，小肠、脾、肺及肿瘤组织中EB含量与对照组相比有显著提高（P&<0.05，P&<0.01）；心、肝、肾、脑组织中EB含量无明显变化（P&>0.05）。
导致EB分布过程和组织中含量差异的主要原因，与各组织血流动力学特点、微血管壁对EB的通透性和对组胺的敏感性以及EB与不同组织的亲和力等因素有关。组胺通过扩张血管、增加微血管壁通透性作用，使对EB亲和力较强的组织有更多的机会接触并富集血液中的EB，从而提高其在组织中的含量。
3 讨 论
抗体偶联的靶向药物因其既可以主动寻找微小肿瘤病灶，又可以高度选择性杀伤肿瘤细胞，成为目前抗肿瘤治疗研究中的热点。有实验表明，131I标记的抗肝癌单抗在肝癌患者中的肿瘤显像率为85％，且单抗的Fab或F(ab′)2片段在体内分布的特异性比完整抗体高［2］，说明抗体偶联药物具有靶向聚集的特性，并且其富集的程度与分子的大小有关。然而事实上到达靶部位的药量极少，据推算肿瘤组织的单抗摄取量仅有0.005％（注入剂量/g），血管壁的通透性构成药物进入瘤体的主要屏障。
有作者用单抗丝裂霉素偶联物与血管活性药物普奈洛尔或血管紧张素Ⅱ联合使用，通过改善肿瘤局部的血供增强肿瘤组织对单抗的摄取量［3］；也有研究者利用血管内皮生长因子（VEGF）提高血管内皮通透性，增加大分子物质在肿瘤内的积聚［4］。前者通过改善局部血流量提高药物浓度的能力有限，后者促进药物摄取的同时也促进肿瘤的生长。
组胺是炎症反应介质之一，能够增加微血管壁通透性并改变局部血供。外源性组胺还具有抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤组织退行性变、增加淋巴细胞在瘤体内渗透等作用。Donskov等［5］在Ⅱ期临床实验中将组胺与IL-2合用治疗转移性肾细胞癌，使患者1年生存率明显改善，并发现肿瘤组织中CD56(+)NK细胞和CD8(+)T细胞数量明显增高。Brunstein等［6］将组胺与马法兰合用代替TNF-α与马法兰组合治疗BN(Brown Norway)大鼠的BN-175移植纤维肉瘤，总有效率66％，其中33％完全缓解，200 g/L组胺患肢动脉给药只引起局部轻度水肿，未见全身不良反应。
本实验中，皮下注射组胺可改变EB在各器官中的分布。即使初始阶段EB在血供丰富的器官中浓度较高，但随着时间的进展，会重新富集于与其亲和力较强的组织。因肿瘤血管对组胺更敏感，且瘤体内血管、淋巴管发育不完善，有许多不相通的盲端，使进入瘤内的EB不易向外弥散，因此瘤体内EB含量明显升高。如果在抗肿瘤治疗中联合应用组胺和抗体偶联药物，将使后者有更多的概率与瘤细胞接触，通过抗原－抗体的特异性结合，使更多的大分子药物在肿瘤局部富集，从而增强其抗肿瘤活性。
另有报道，恶性肿瘤患者体内组胺水平低，机体对组胺敏感性差，大剂量(4 mg/d)组胺并不引起血压下降、皮肤潮红、支气管痉挛等副作用，这为组胺的临床应用提供了安全保障。
【参考文献】
［1］ Dykes PW， Bradwell AR， Chapman CE， et al. Radioimmunothe-rapy of cancer: clinical studies and limiting factors［J］. Cancer Treat Rev， 1987，14(2):87-106.
［2］ 甄永苏. 抗肿瘤导向药物研究的现状与展望［J］. 药学学报，1994，29(1):1-8
［3］ Zhou SQ， Wang NQ， Liu T， et al. Experimental study of tumor directed therapy with gastric cancer monoclonal antibody-mitomycin conjugate combined with propranolol or angiotensinⅡ［J］. Acta Pharmaceutica Sinica，1992，27（12）:891-894
［4］ Roberts WG， Hasan T. Tumor-secreted vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor influences photosensitizer uptake［J］. Cancer Res，1993，53(1):153-157.
［5］ Donskov F， Hokland M， Marcussen N， et al. Monocytes and neutrophils as ‘bad guys’ for the outcome of interleukin-2 with and without histamine in metastatic renal cell carcinoma--results from a randomised phase II trial［J］. Br J Cancer， 2006，94(2):218-226.
［6］ Brunstein F， Santos ID， Ferreira LM， et al. Histamine combined with melphalan in isolated limb perfusion for the treatment of locally advanced soft tissue sarcomas: preclinical studies in rats［J］. Acta Cir Bras， 2005，20(4):275-279.