【摘要】 目的 观察异丙肾上腺素致大鼠心衰后心肌细胞对不同浓度的Ca2+和异丙肾上腺素的反应。方法 用异丙肾上腺素制作大鼠心衰模型;测血流动力学指标验证；动物随机分为正常组和心衰组;分离心肌细胞测定细胞存活率和单个细胞在不同浓度Ca2+和异丙肾上腺素刺激下的收缩幅度。结果 与正常对照组比较，心衰组大鼠血流动力学明显改变（P&<0.05），心肌细胞存活率下降（P&<0.01），对不同浓度的Ca2+和异丙肾上腺素的反应也较同浓度正常对照组心肌细胞收缩幅度下降（P&<0.01）。结论 排除神经和体液因素的影响后，心衰大鼠心肌细胞自身对Ca2+和异丙肾上腺素的反应性下降。
【关键词】 心力衰竭 心肌细胞 异丙肾上腺素
Abstract: Objective To investigate the reaction of cardiomyocytes from isoproterenol-induced heart failure rat to different concentrations of calcium and isoproterenol. Methods SD rats were randomly pided into a heart failure group and a control group， with the former used to induce heart failure with isoproterenol. The hemodynamic parameters of the animal and the contraction amplitude and survival rate of isolated cardiomyocytes were examined. Results Compared with those in the control group， the blood pressure and ±dp/dt in heart failure group were decreased significantly (P&< 0.05); the cardiomyocyte survival rate and contraction amplitude were significantly reduced (P&<0.01). Conclusion With the neural and humoral regulations excluded， the contraction of cardiomyocytes themselves is reduced in isoproterenol-induced heart failure rats.
Key words: heart failure; cardiomyocytes; isoprenaline
心衰是包括心肌梗死、心肌炎、高血压性心脏病等心血管疾病的最后阶段。这些疾病往往引起心肌细胞的凋亡和细胞数目减少，最终导致心衰。目前，大多数研究都是在整体水平上观察心肌细胞的改变，本研究排除神经和体液等因素的影响，在细胞水平上直接观察了心衰后单个心肌细胞对Ca2+和β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素的反应，为心衰的研究进一步提供理论和实验依据。
1 材料和方法
1．1 实验动物 实验选用成年健康的Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不拘，体重200~250 g，由徐州医学院实验动物中心（使用许可号：SYXK［su］2002-0038）提供。动物随机分成不同的组，每组12只，自由饮水和饮食。
1．2 主要试剂 盐酸异丙肾上腺素（ISO，Sigma公司），胶原酶Ⅱ型（Gibco公司），透明质酸酶（Sigma公司），Hepes（北京华美），DMEM(高糖)培养基（Hyclone公司），牛磺酸（Sigma公司），肌酸（Sigma公司），牛血清白蛋白（Amresco公司）。
1．3 心力衰竭动物模型的制作 参考Rona等［1］异丙肾上腺素所致心衰的方法略作修改。心衰组腹腔注射异丙肾上腺素4 mg/kg，1次/d，连续3天。
1．4 正常及心衰大鼠血流动力学测定 大鼠注射异丙肾上腺素完成1周后，存活8只，用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，分离右颈总动脉，置入微压力传感导管，测血压及左心室压力最大上升、下降速率（±dp/dt）变化，考查模型成功情况。
1．5 正常及心衰大鼠心肌细胞对不同浓度Ca2+和 ISO的反应
1．5．1 心肌细胞的分离和培养 大鼠测完血流动力学指标后，迅速开胸取心脏，悬挂心脏于Langendorff 灌注装置上，经主动脉逆行灌流分离心肌细胞［2］。将新分离的正常和心衰心肌细胞计数后，分为正常组和心衰组，接种于12孔培养板上，置于CO2培养箱中悬浮培养24 h。
1．5．2 培养心肌细胞存活率的计算 将长杆状细胞定为有功能的细胞，心肌细胞存活率=（长杆状细胞数量/ 全部细胞数量）×100%。
1．5．3 单个心肌细胞收缩功能的测定 把培养的各组心肌细胞置于心肌细胞收缩功能分析装置的细胞浴槽中［3］，用蠕动泵将含有不同浓度的Ca2+和ISO的KH液循环至细胞槽内，然后用刺激器（0.5 Hz，37℃）对细胞进行刺激。选择横纹清晰、胞膜完整、长杆状的心肌细胞进行分析。
1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0软件分析，数据以x±s表示，2组间均数比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，检验水准：α=005。
2 结 果
2．1 血流动力学变化 与正常组比较，心衰组收缩压(SP)和舒张压(DP) 升高，心室内压变化速率(±dp/dt)的绝对值下降(P&<0.05)。表明模型制作成功。表1 血流动力学测定结果
2．2 正常和心衰大鼠心肌细胞的存活率 心肌细胞培养24 h后，正常组心肌细胞存活率为（80.67±3.33）%，高于心衰组心肌细胞的（63.50±3.73）%（P&<0.01）。
2．3 正常和心衰大鼠心肌细胞收缩幅度 在不同浓度Ca2+刺激下（表2），心衰组心肌细胞收缩幅度都较同浓度正常组降低（P&<0.01）。随着Ca2+浓度增高，正常组和心衰组心肌细胞收缩幅度都增强（P&<0.01）。
3 讨 论
在整体水平上，心脏受神经、体液和自身等因素的影响，心肌细胞也是处于相当复杂环境中受许多因素作用的。心力衰竭时，心脏功能下降，但这时单个心衰心肌细胞功能是否变化，我们了解并不多。因此，用SIO制作了大鼠心衰模型，然后分离心衰大鼠心肌细胞，用无血清DMEM培养基培养，排除了神经、体液等在体因素的影响和非心肌细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）对心肌细胞的干扰，在一个可控制的环境中对心衰心肌细胞的特性进行检测，去观察单个心肌细胞自身情况的变化。
从实验结果可以看到：随着Ca2+浓度增高，单个心衰心肌细胞收缩幅度增高，但都较同一浓度下单个正常心肌细胞的收缩幅度降低。在本实验中发现，Ca2+浓度在大于4 mmol/L时，心衰心肌细胞开始出现痉挛，说明心衰时，单个心肌细胞自身的功能也是下降的；用不同浓度ISO刺激心肌细胞，心衰心肌细胞随ISO浓度增高收缩幅度增强， 但都较同一浓度下正常心肌细胞收缩幅度降低，说明心衰心肌细胞对儿茶酚氨的反应性较正常心肌细胞降低，在ISO浓度达到1000 nmol/L时，正常和心衰心肌细胞收缩幅度均不再增强。据文献报道［4］，在整体水平上，长期暴露于肾上腺素激动剂的心肌组织容易死亡。这可能与心肌肥大和心衰时肌质网内钙ATP酶蛋白浓度降低有关［5］，并且随着心肌肥大的发展，降低也愈明显，从而导致对Ca2+的摄取障碍；另外，长期交感神经刺激，心肌细胞肥大，使心肌耗氧增加，心肌细胞由于能量供应不足，也影响心肌细胞收缩功能［6］。本实验结果还显示：心衰的心脏心肌细胞存活率较正常心脏降低，而大量资料表明：心肌细胞丧失可能是心力衰竭形成的一个重要基础［7］。
【参考文献】
［1］ Rona G， Chappel CI， Balazs T， et al. An infarct-like myocardial lesion and other toxic manifestation produced by isoproterenol in the rat［J］. AMA Arch Pathol，1959，67(4):443-455
［2］ 王 影，孙 红，范乐明，等.成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术［J］.徐州医学院学报，2005，25（5）:393-396
［3］ Harding SE， Vescovo G， Kirby M， et al. Contractile responses of isolated adult rat and rabbit cardiac myocytes to isoproterenol and calcium［J］. J Mol Cell Cardiol，1988，20(7):635-647
［4］ Rona G， Zsoter T， Chappel C， et al. Myocardial lesions， circulatory and electrocardiographic changes produced by isoproterenol in the dog［J］. Rev Can Biol，1959，18(1):83-94
［5］ Sipido KR， Volders PG， de Groot SH， et al. Enhanced Ca2+ release and Na+/Ca2+ exchange activity in hypertrophied canine ventricular myocytes: potential link between contractile adaptation and arrhythmogenesis［J］ . Circulation，2000，102(17):2137-2144
［6］ Sun H， Zhou F， Wang Y， et al. Effects of beta-adrenoceptors overexpression on cell survival are mediated by Bax/Bcl-2 pathway in rat cardiac myocytes［J］. Pharmacology，2006，78(2):98-104
［7］ Haunstetter A， Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease［J］. Circ Res，1998，82（11）:1111-1129