作者：孙亚峰 裴冬生 张光毅
【摘要】 目的 观察脑缺血再灌注后海马Src家族酪氨酸蛋白激酶（Src family of protein tyrosine kinase， Src PTKs）成员Src、Fyn激酶对NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptors， NMDAR， NR)NR2A亚基磷酸化水平的影响。方法 采用Pulsinelli-Brierley四动脉阻断（four-vessel occlusion， 4-VO）大鼠全脑缺血模型，缺血前连续3天脑室注射Src、Fyn反义寡核苷酸（antisense oligode oxynucletides，AS-ODNs）及错义寡核苷酸组（missense oligodeoxynucletides，MS ODNs）后缺血15 min，用免疫沉淀和免疫印迹法检测NR2A亚基酪氨酸磷酸化水平的变化。结果 Fyn反义寡核苷酸使脑缺血再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平下降，而Src反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平影响更加明显。结论 脑缺血/再灌注过程中NMDA受体NR2A亚基的磷酸化主要是由Src激酶介导的。
【关键词】 Src；Fyn；NR2A；反义寡核苷酸；脑缺血
Abstract: Objective To investigate whether tyrosine protein kinases Src and Fyn were involved in the phosphorylation of NR2A induced by cerebral ischemia followed by reperfusion. Methods Transient (15 min) brain ischemia was induced by the four-vessel occlusion in Sprague-Dawley rats. The antisense oligodeoxynucleotides (ODNs) of Src and Fyn were used to suppress the expression of Src and Fyn by intracerebroventricular infusion once a day for 3 days before ischemia. Western blot was used to examine the phosphorylation of NR2A in rat hippocampus. Results Both Src and Fyn antisense ODNs could decrease the phosphorylation of NR2A induced by cerebral ischemia/reperfusion， while administration of Src antisense ODNs had more suppressive effect on the phosphorylation of NR2A than Fyn antisense ODNs. Conclusions The phosphorylation of NMDA receptor subunit NR2A during cerebral ischemia followed by reperfusion is primarily mediated by kinase Scr.
Key words: Src; Fyn; NR2A; antisense oligodeoxynucleotides; cerebral ischemia
近年来，最受人们关注的缺血性脑损伤机制是兴奋性氨基酸（excitatory amino acid， EAA）的神经毒性作用及神经元内钙超载触发的级联反应［1］，其中NMDA受体（NR）的NR2亚基在缺血性脑损伤中起着非常重要的作用，在缺血/再灌注（ischemia/ reperfusion，I/R）过程中其蛋白表达、磷酸化水平均有改变。对NR2亚基有磷酸化调节作用的是Src家族酪氨酸蛋白激酶（Src family of protein tyrosine kinase， Src PTKs），这是一类膜结合的非受体酪氨酸蛋白激酶；现已知Src家族成员中Src、Fyn、Yes、Lyn、Lck在中枢神经系统中均有表达。本实验采用四动脉阻断（4-VO）大鼠全脑缺血模型，观察Src家族成员中Src、Fyn激酶对海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 成年雄性SD大鼠，体重230～250 g，中国科学院上海实验动物中心提供(Ⅱ级，证书号005)。
1.1.2 药物 Src、Fyn反义、错义寡核苷酸均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，硫代磷酸修饰。Src蛋白的反义寡核苷酸（Src As-ODNs）序列是:①5′ATG GGT AGC AAC AAG AGC AAG CC 3′；②5′CAC AAG CGA CGG TGA GAA GCT AA 3′。Fyn蛋白的反义寡核苷酸（Fyn As-ODNs）序列是:①5′CGT CAG TTT CGC TGC TTC TTT 3′；②5′CGT TGT CAA GCT TGC GGA TTT 3′；③5′ TCC AGG TAC CCA TCC ATA CTT 3′。临用前混合溶于Tris-EDTA缓冲液（10 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）。Src蛋白的错义寡核苷酸（Src Ms-ODNs）序列是：5′ACA GAG CAC CAG TGA GTA AGC AG3′，Fyn蛋白的错义寡核苷酸（Fyn Ms-ODNs）序列是：CTC GAG TCA CAC CTC AAT TCT3′。
1.2 方法
1.2.1 四动脉阻断全脑缺血模型 按Pulsinelli［2］法进行。水合氯醛麻醉大鼠，分离双侧颈总动脉，挂线备用，然后用电凝针电凝双侧椎动脉。12 h后，在大鼠清醒状态下，游离出双侧颈总动脉，用动脉夹阻断血流，缺血15 min，在缺血时大鼠肛温维持在36.5～37.5℃。随机分组：①Sham组，手术不缺血；②I/R 6 h组；③溶剂对照组（saline），脑室注射相同剂量的生理盐水；④I/R 6 h+Src As-ODNs组；⑤I/R 6 h+Fyn As-ODNs组；⑥I/R 6 h+Src Ms-ODNs组。⑦I/R 6 h+Fyn Ms-ODNs组。每只8只大鼠。缺血前3天经脑室注射给药，注射第3天缺血。术后再灌注6 h。
1.2.2 脑室注射及取材 SD大鼠乙醚麻醉后固定于大鼠脑定位仪上，消毒剪开头皮，暴露前囟点，钻孔脑室注射Src、Fyn As-ODNs和Ms-ODNs（后开0.8 mm，旁开1.5 mm，深3.5 mm），注射体积10 μl，速度1 μl/min，留针5 min，以1 mm/min速度取针，缝合切口。连续注射3天后缺血15 min，再灌注6 h，立即断头取双侧海马，液氮中冻存。
1.2.3 免疫沉淀 海马样品加入冰冷的匀浆液（mmol/L）：50 Mops， pH 7.4， 100 KCl， 0.5 MgCl2， 0.2 DTT， 1 Na3VO4， 0.1 EDTA， 1 EGTA， 0.5鸟本苷，0.1 PMSF；5 μg/ml leupeptin和5 μg/ml pepstatin A，0.32 mol/L蔗糖，Teflon匀浆。匀浆液4000 g离心10 min，上清液加入SDS(0.5%)和DTT(1 mmol/L)，煮沸5 min，缓冲液（mmol/L：20 MOPS，pH 7.4，150 NaCl，1%Triton X-100，0.5% NP-40，1 EDTA，1 EGTA，0.2 Na3VO4，0.2 PMSF）稀释4倍。加入蛋白A-Sepharose(50 μl)保温45 min，离心，上清与磷酸酪氨酸抗体（p-Y，Sigma ）4℃保温4 h，加入蛋白A-sepharose(50 μl)4℃ 4 h，离心，收集沉淀样品。
1.2.4 免疫印迹 上述样品(50 μg/L)经SDS-PAGE分离后，以湿转法电转至NC膜上（Amershan），室温封闭3 h（1%BSA，10 mmol/L Tris，pH 7.5，10 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20），加入NR2A抗体（Sigma）4℃过夜，二抗37℃保温2 h，室温30 min后，封闭液洗膜后NBT/BCIP显色，图像处理仪（Gene Company）分析结果。
1.3 数据处理 数据以±s表示，两组间数据比较采用新复极差法，多组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P&<0.05为有统计学意义。
2 结 果
脑缺血15 min再灌注6 h后(I/R 6 h组)，NR2A亚基的磷酸化水平迅速升高，溶剂对照组和I/R6 h+Ms-ODNs组与其类似，I/R 6 h+Src As-ODNs组NR2A亚基的磷酸化水平与I/R 6 h组比较有明显降低（P&<0.05）；I/R 6 h+Fyn As-ODNs组与I/R 6 h组比较，NR2A亚基的磷酸化水平略有降低（图1，表1）。表1 图像分析仪分析免疫印迹的数值
3 讨 论
在缺血性脑损伤发生进程中兴奋性氨基酸的神经毒性作用及神经元内钙超载触发的级联反应主要由谷氨酸受体的一种亚型NMDA受体（N-methyl-D-aspartate receptors， NMDAR， NR）通道介导。NR在缺血性脑损伤中起着非常重要的作用，主要由NR1亚基和NR2亚基（NR2A-NR2D）［3］组成，NR1亚基构成离子通道，NR2为调节亚基，不能单独构成离子通道。
NR2亚基在缺血性脑损伤中所起的作用，近年来研究多集中在NR2各亚基mRNA表达水平的变化以及磷酸化程度的改变，而NR2亚基的酪氨酸磷酸化即酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，PTK）在脑缺血性损伤中的作用备受关注，PTK可磷酸化NMDA受体的NR2亚基，但这个过程需要突触后致密体PSD-95的介导［4］。
文献报道［9-10］在缺血性损伤中，NR2A、NR2B的磷酸化水平均有所升高，但其升高程度及磷酸化对缺血的敏感程度不同，Src、Fyn的活性显著升高，Src、Fyn与NR2A/NR2B的结合量增加；而用Src、Fyn反义寡核苷酸抑制其蛋白表达可减轻大鼠脑海马CA1区神经元的缺血性损伤。证明Src PTKs介导的NR2酪氨酸磷酸化参与了缺血/再灌注NR功能的上调，进一步加重了缺血性脑损伤。本实验发现Src、Fyn反义寡核苷酸均可使NR2A亚基磷酸化程度下降，但是Src反义寡核苷酸的作用更为明显。由此可见Src、Fyn激酶介导的NR2A亚基磷酸化水平的调节机制存在差异，这可能是由于Src主要通过磷酸化NR2A起作用，而Fyn则主要通过磷酸化NR2B起作用。在脑缺血性损伤发生过程中Src PTKs是否通过这样的途径磷酸化NR2的不同亚基而起作用，需要进一步的实验证实，这将是我们继续深入研究的工作重点。
参考文献
［1］ Zhou S， Yang Y， Gu X， et al. Chit oligosaccharides protect cultured hippocampal neurons against glutamate-induced neurotoxicity ［J］. Neurosci Lett，2008，444(3):270-274.
［2］ Pulsinelli WA， Brierlsy JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat ［J］. Stroke，1979，10(3):267-272.
［3］ Brabet I， Parmentier ML， De CC， et al. Comparative effect of L-CCG-I， DCG-IV and gamma-carboxy-L-glutamate on all cloned metabotropic glutamate receptor subtypes ［J］. Neuropharmacology，1998，37(8):1043-1051.
［4］ Ali DW， Salter MW. NMDA receptor regulation by Src kinase signalling in excitatory synaptic transmission and plasticity ［J］. Curr Opin Neurobiol，2001，11(3):336-342.
［5］ Soriano FX， Martel MA， Papadia S， et al. Specific targeting of pro-death NMDA receptor signals with differing reliance on the NR2B PDZ ligand ［J］. J Neurosci，2008，28(42):10696-10710.
［6］ Hubbard SR， Till JH. Protein tyrosine kinase structure and function ［J］. Annu Rev Biochem，2000，69:373-398.
［7］ Sala C， Sheng M. The fyn art of N-methyl-D-aspartate receptor phosphorylation ［J］. Proc Natl Acad Sci，1999，96(2):335-337.
［8］ Yu XM， Askalan R， Keil GJ， et al. NMDA channel regulation by channel -associated protein tyrosine kinase Src ［J］. Science，1997，275(5300):674-678.
［9］ Meng FJ， Guo J， Song B， et al. Competitive binding of postsynaptic density 95 and Ca2+-calmodulin dependent protein kinase II to N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B in rat brain ［J］. Acta Pharmacol Sin，2004，25(2):176-180.
［10］ 孙亚峰，裴冬生，张光毅.酪氨酸蛋白激酶Src和Fyn对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经细胞损伤的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2008，25(4):437-439.