作者：姜平 戴如飞 蔡军 刘宁 骆慧 闫志海 阎超
【摘要】 目的 探讨电离辐射对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene， PTTG）表达的影响。方法 胶质瘤C6细胞分为4组（n=6）：A组（空白对照组）、B组（2 Gy剂量X射线组）、C组（4 Gy剂量X射线组）、D 组（6 Gy剂量X射线组），X射线照射后12 h，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测PTTG mRNA的表达，免疫细胞化学检测其蛋白表达。结果 PTTG mRNA在X射线处理组均降低，随着X射线剂量的增加，其表达降低越明显，A、B、C、D 4组的表达分别为 1.910±0.141、 1.398±0.157、1.010±0.133、0.743±0.092，各组间差异均有统计学意义(P&< 0.01)。PTTG蛋白积分光密度 (integrated optical density，IOD) 在X射线处理组均降低，随着X射线剂量的增加，其表达降低越明显，A、B、C、D 4组的IOD分别为1.840±0.089、1.395±0.139、0.893±0.125、 0.597±0.104，各组间差异均有统计学意义(P&< 0.01)。结论 电离辐射可以剂量依赖的方式降低胶质瘤C6细胞PTTG mRNA及其蛋白的表达。
【关键词】 胶质瘤；电离辐射；垂体瘤转化基因
Abstract: Objective To investigate the effect of ionizing radiation on the expression of pituitary tumor transforming gene (PTTG) in glioma C6 cells. Methods Glioma C6 cells were pided into 4 groups (n=6): group A (control group)， group B (2 Gy doses of X-ray group)， group C (4 Gy doses of X-ray group)， group D (6 Gy doses of X-ray group). The expression of PTTG mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 12 hours after X-ray irradiation and the expression of PTTG protein was detected by immunostaining assay using streptavidin-peroxidase (SP) method. Results The expression of PTTG mRNA decreased in X-ray treatment groups， which was positively correlated with the increase of X-ray doses. The expression of PTTG mRNA in groups A， B， C and D were 1.910±0.141， 1.398±0.157， 1.010±0.133， 0.743±0.092， respectively. There were significant differences between these groups (P&<0.01). The expression of PTTG protein decreased in X-ray treatment groups， which was also positively correlated with the increase of X-ray doses. The integrated optical density (IOD) of PTTG protein in groups A， B， C and D were 1.840±0.089， 1.395±0.139， 0.893±0.125， 0.597±0.104， respectively. There were significant differences between these groups (P&<0.01). Conclusion Ionizing radiation can decrease the expression of PTTG mRNA and the protein in glioma C6 cells in a dose-response relationship.
Key words: glioma; ionizing radiation; pituitary tumor transforming gene
很多实验已经证实X射线可以影响众多参与肿瘤发生、发展的基因的表达，通过基因改变对肿瘤细胞周期的调控而调节肿瘤细胞的增殖和凋亡。垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene， PTTG）是一种促进肿瘤细胞生长的基因，而电离辐射对该基因有何影响，国内外均鲜见报道。本研究应用不同剂量的X射线作用于胶质瘤C6细胞，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测PTTG mRNA的表达，免疫细胞化学检测其蛋白表达，探讨电离辐射对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因表达的影响，为探讨放疗对肿瘤细胞增殖和凋亡的调节机制提供新的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 胶质瘤C6细胞（中国科学院上海分院），DNTP、Taq DNA聚合酶（dT）、Oligo15、 AVM逆转录酶(Promega公司)，鼠抗人PTTG单克隆抗体 (Santa Cruz公司)，链亲合素卵白素-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase， SP) 、DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。
1．2 细胞培养、X射线处理及分组 胶质瘤C6细胞在含有 10%新生小牛血清、青霉素1×105 U/L、链霉素1×105 U/L DMEM培养基中，5% CO2、37℃条件下培养。分为A、B、C、D 4组（n=6）。A组（空白对照组）不进行X射线照射处理；对数生长期的细胞采用医用直线加速器的6 MV X射线照射，按照射剂量分为2 Gy （B组）、4 Gy（C组）、6 Gy（D组） 3个剂量组，照射野为10 cm×10 cm，等中心照射，照射完毕常规培养12 h后进行检测。
1．3 RT-PCR 检测PTTG mRNA的表达 Trizol提取总RNA，分光光度计测定RNA的浓度和纯度。RT-PCR 检测PTTG mRNA的表达，以β2-微球蛋白（β2-M）为内参照，设计PTTG、β2-M引物序列如下（上海生物工程公司合成）：PTTG引物上游5′-CTAAGGATGGGCTGAAGCTG-3′，下游5′-CAAACAGGTGGCAATTC-3′，扩增长度496 bp；β2-M引物上游5′-GTAAGCAGCATCATGCA-3′，下游5′-TGGAGGAACCTGGTCA-3′，扩增长度300 bp。合成cDNA的第一链反应体系为25 μl，包括Oligo15 0.5 μg， AVM逆转录酶10 U。以cDNA为模板的PCR反应体系包括：逆转录混合液4 μl，Taq DNA聚合酶0.8 μl，两种引物(50 μmol/L)各1 μl。PCR循环条件：变性95℃ 5 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，延伸72℃10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶在图像分析系统分析，计算PTTG的光密度值，以β2-M的光密度值为参照，计算比值。
1.4 免疫细胞化学检测PTTG蛋白表达 制备细胞片，采用SP法检测PTTG蛋白表达，以肿瘤细胞中出现黄色或棕黄色着色或颗粒为PTTG蛋白阳性表达：阳性染色细胞条件为细胞结构清晰、阳性颗粒定位好、着色与背景对比清晰。应用图像分析系统进行图像分析，每张切片随机选取3个高倍视野（×200），分别测得3个视野积分光密度(integrated optical density，IOD)值后取平均值。
1.5 统计学处理 用SPSS 10.0 统计软件进行数据处理。 实验数据以±s表示，实验结果采用单因素方差分析总体有差异后，LSD进一步两两比较各组间差异。P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同剂量X射线对胶质瘤C6细胞PTTG mRNA表达的影响 RT-PCR 检测PTTG mRNA的表达显示有496 bp片断的PTTG mRNA特异扩增条带（图1）。与A组比较，不同剂量的X射线均可降低PTTG mRNA的表达，其降低水平随着X射线剂量的增加而增加，单因素方差分析表明4组总体间差异有统计学意义（P＜0.01），LSD进一步两两比较各组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。
2.2 不同剂量X射线对胶质瘤C6细胞PTTG蛋白表达的影响 PTTG蛋白阳性表达显示主要定位于肿瘤细胞的胞质，弥漫性全细胞分布，少量定位于细胞核（图2）。与A组比较，不同剂量的X射线均可降低PTTG蛋白的表达，其降低水平随着X射线剂量的增加而增加。单因素方差分析表明4组总体间差异有统计学意义（P＜0.01），LSD进一步两两比较显示各组间差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。表1 不同剂量X射线处理后PTTG mRNA及蛋白的表达情况
关于电离辐射对基因表达的影响国内外均有较多的报道。各种不同基因的表达对电离辐射的反应不同。鞠桂芝等［1］发现电离辐射可显著促进昆明小鼠胸腺p16 mRNA及其蛋白的表达。Hamasu等［2］报道，5 Gy X射线照射可诱导MKN45及MKN28胃癌细胞凋亡，同时caspase表达明显增高。李平法等［3］报道5 Gy γ射线能显著诱导人乳腺癌细胞hR24L基因的表达。盛方军等［4］证实电离辐射后AT细胞hTERT mRNA表达水平上升，闫风琴等［5］发现电离辐射可以上调小鼠EL-4淋巴瘤细胞P21蛋白表达水平，Samuni等［6］证实电离辐射能增强人淋巴母细胞瘤中p53的表达。刘光伟等［7］的研究结果表明电离辐射可以诱导生精细胞P53蛋白表达增加的同时凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达下降。
PTTG是Pei于1997年首次从大鼠垂体腺瘤GH4细胞中发现的基因，该基因含5个外显子、4个内含子，编码199个氨基酸组成的相对分子质量为25 000的蛋白。PTTG在众多肿瘤中对加速细胞分化、加快肿瘤血管生成、促进肿瘤形成起到重要的作用。PTTG作为促进肿瘤发生、发展的基因与肿瘤细胞周期的调控有密切的关系。关于电离辐射对PTTG的影响国内外鲜见文献报道。本实验运用不同剂量的X射线作用于胶质瘤C6细胞，结果显示电离辐射可降低PTTG mRNA及其蛋白表达水平，并且呈一定的剂量依赖性，即随着X射线剂量的增高，其表达水平下降更明显。
细胞的辐射敏感性随着细胞周期时相而改变，在G1期有一定的抵抗性，随着向S期移行敏感性降低，在G1/S边界上敏感性上升，进入S期后下降，在S期末达到最高。进入G2和M期，细胞敏感性上升，即细胞对辐射的敏感性按M期、G2期、G1期、早S期、晚S期依次递减。有研究表明，正常情况下PTTG的表达与肿瘤的细胞周期有明显的相关性。Ramos-Morales等［8］将培养在10%清中的HeLa细胞或Cos细胞转移至0.15%血清中3天以造成细胞缺乏营养，细胞有丝分裂减少，然后检测两种标本中PTTG的表达，发现当细胞有丝分裂时PTTG mRNA的表达明显增高。进一步研究发现PTTG在细胞有丝分裂的G1/S交界期最低，Ｓ期升高；在G2/M交界期最高，G1期又开始降低。同时研究证实，在细胞有丝分裂时PTTG蛋白上的Ser165位点被Cdc2磷酸化。当Ser165被Ala替代时或受到Cdc2抗体的干扰时，则PTTG的磷酸化水平下降。这说明PTTG的表达呈细胞周期依赖性。我们认为电离辐射对PTTG的影响可能是通过对细胞周期的影响实现的。
本实验初步证实了电离辐射能降低PTTG的表达水平，但同一剂量的放射线在不同时间对PTTG表达的影响如何，该基因对电离辐射的损伤是否有自我修复功能将是我们下一步研究的内容。
【参考文献】
［1］ 鞠桂芝，王小梅，付士波，等.电离辐射对p16基因转录及蛋白表达的的影响［J］ .中华放射医学与防护杂志，2003，23（1）：4-6.
［2］ Hamasu T， Inanami O， Asanuma T， et al. Enhanced induction of apoptosis by combined treatment of human carcinoma cells with X rays and death receptor agonists ［J］. J Radiat Res (Tokyo)， 2005， 46(1):103-110.
［3］ 李平法， 朱应葆，韩 云，等.电离辐射对人乳腺癌细胞hR24L基因表达的影响［J］ .癌变·畸变·突变，2001，13（2）：67-70.
［4］ 盛方军，曹建平，朱 巍，等. 时间因素对电离辐射后AT细胞hTERT mRNA表达的影响［J］ .苏州大学学报（医学版），2006(4):535-538.
［5］ 闫风琴，王建秋，付士波，等.电离辐射对小鼠EL-4淋巴瘤细胞P21蛋白表达的影响［J］ .中华放射医学与防护杂志，2005，25（6）：514-516.
［6］ Samuni AM， Kasid U， Chuang EY， et al. Effects of hypoxia on radiation-responsive stress-activated protein kinase， p53， and caspase 3 signals in TK6 human lymphoblastoid cells ［J］. Cancer Res， 2005， 65(2):579-586.
［7］ 刘光伟，董丽华，王珍琦，等.低剂量电离辐射对小鼠睾丸生精细胞P53和Bcl-2蛋白表达的影响［J］.吉林大学学报（医学版），2004，30（1）：85-88.
［8］ Ramos-Morales F， Dominguez A， Romero F， et al.
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