作者：温相如，关秋华，张光毅
【摘要】 目的 观察大鼠脑缺血/再灌注后海马CA1区热休克蛋白90 (HSP90)的表达。方法 应用免疫印迹法观察大鼠脑缺血/再灌注后不同时间点海马CA1区HSP90的表达。结果 缺血/再灌注30 min后HSP90的表达开始增高，6 h达最高峰，持续升高至第3天，6 h后HSP90的表达与对照组相比较有显著性差异(P&<0.05)。结论 大鼠脑缺血/再灌注早期可诱导海马CA1区HSP90的合成及表达增加，表明HSP90参与了脑缺血有关的病理及生理过程。
【关键词】 脑缺血/再灌注；热休克蛋白90；海马CA1区
目前普遍认为热休克蛋白(heat shock protein90，HSP90）是一类应激保护性蛋白。有文献表明HSP90和相当数量的信号分子相互关联，并通过对底物蛋白的作用，影响疾病的发生和发展。由于HSP90属应激反应蛋白，而海马CA1区是大鼠脑缺血最敏感的区域，短暂性的脑缺血/再灌注（I/R）过程中，HSP90在海马CA1区锥体细胞内的表达，是反映缺血敏感而可靠的指标。本实验对脑缺血/再灌注过程中大鼠海马CA1区HSP90的表达进行检测并探讨其在缺血性神经元损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验材料 雄性SD大鼠，250～300 g，清洁级，徐州医学院实验动物中心提供；anti-HSP90由Santa Cruz公司提供；二抗和标准牛血清白蛋白均购自美国Sigma公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备 参照已建立的大鼠四动脉结扎模型［1］，动物以20%水合氯醛( 300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，电凝椎动脉。手术第2天动物分别在缺血前随机分为假手术组及脑缺血/再灌注0 min、30 min、3 h、6 h、16 h、1 d、3 d组，每组5只；于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15 min，然后再灌注。缺血时保持大鼠直肠温度36.5～37.5℃，以体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组不结扎双侧颈总动脉。
1.2.2 样品制备 大鼠缺血15 min再灌注后，按照再灌注时间的不同，断头快速取脑，分离双侧海马，沿海马裂将CA1区分离出来，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马CA1区加0.8 ml匀浆缓冲液，用Glas－Col匀浆器高速匀浆（10 s×12次），4℃下800 g离心15 min，移取上清液（主要为胞质部分），测蛋白后分装，置-80℃冰箱待用。
1.2.3 蛋白含量测定 按Lowry等［2］方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
1.2.4 免疫印迹法 按Hu等［3］方法，等量蛋白样品经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以半干转法电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3% BSA封闭后加入稀释好的一抗，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗，室温孵育2 h，以NBT/BCIP显色，水洗终止反应，扫描显色条带并以LabWorks软件分析处理。
1.3 统计学处理 数据用统计分析软件Sigma Stat 3.2处理，以±s表示，采用q检验（Newman-Keul test），P&<0.05为有显著性差异。
2 结 果
按I/R时间的不同，对各组海马CA1区的HSP90进行免疫印迹检测，结果发现从I/R 30 min开始HSP90的表达开始增高，6 h达最高峰，并持续升高至第3天，而且I/R 6 h组与假手术组相比较有显著性差异(P&<0.05)。见图1。
HSP90作为分子伴侣中的一员，在进化上高度保守，人体细胞内HSP90分为α型和β型，两者间同源性为84%，其共同结构特征为N 端含有ATP酶结合位点，C端则含有形成HSP90同源二聚体所必需的由190个氨基酸残基组成的结合亚单位［4］。HSP90的底物多为涉及信号传递的蛋白质，HSP90对其稳定性和活性具有重要的调节作用。有研究表明HSP90的分子伴侣功能需要ATP的结合和水解，同时依赖于不同的辅助伴侣分子构成伴侣蛋白复合体［5］。依结合ATP/ADP状态的不同以及辅助伴侣分子的不同，HSP90对底物蛋白发挥着截然相反的调节作用。当ATP与HSP90结合时，HSP90与p23和p50Cdc37形成伴侣复合体，该复合体有助于HSP90底物蛋白的稳定及活性；而当HSP90与ADP结合时，HSP90与HSP70以及p60Hop形成的伴侣复合体却促进底物蛋白的泛素化并经蛋白酶体通路降解［6］。新近的研究表明HSP90和辅助伴侣分子p50cdc37还参与了对JNK及p38上游激酶MLK3 (mixed lineage kinase3)稳定性和活性的调节，当HSP90功能受到抑制时，MLK3激酶水平明显降低，TNFα诱导的MLK3及JNK的活化随之被阻断［7］，这一结果提示可能一些促进凋亡的蛋白质同样受到HSP90伴侣功能的调控。本实验结果表明，脑缺血/再灌注诱导了海马CA1区HSP90的过表达，HSP90的过表达参与了脑缺血的病理与生理过程，其原因可能与促凋亡通路JNK信号通路相关，也可能与脑缺血后神经细胞的内源性保护机制有关。
【参考文献】
［1］ Pulsinelli WA， Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat ［J］ . Stroke， 1979，10(3):267-272.
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