作者：冯建忠，高媛媛，汤道权，刘燕，王建，钱宇锦
【摘要】 目的 建立HPLC-ELSD法测定银杏叶提取物（extract of Ginkgo biloba，EGb）及其制剂中银杏内酯A、B、C及白果内酯含量。方法 以Kromasil C18为固定相，甲醇-四氢呋喃-水（1∶24∶75）为流动相，流速0.8 ml/min；柱温：35℃；蒸发光散射检测器蒸发温度为100℃，气体流速为2.5 L/min。结果 银杏内酯A、B、C、白果内酯的定量限分别为0.106、0.104、0.105、0.105 mg/ml，银杏内酯A、B、C、白果内酯分别在0.127～0.506、0.129～0.548、0.131～0.576、0.131～0.561 mg/ml 浓度范围内其峰面积与浓度的线性关系良好（r＞0.999），方法回收率为92.4% ～100.8%，日内精密度及日间精密度的变异系数分别小于2%、3%。结论 HPLC-ELSD法简单、准确，为银杏叶提取物中内酯类成分的质量控制提供了依据。
【关键词】 高效液相色谱 蒸发光散射检测器 银杏叶提取物 含量测定
Abstract： Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) with evaporative light-scattering detector (ELSD) to determine the content of ginkgolide A， B， C and bilobalide in the extract of Ginkgo biloba (EGb) leaves and its pharmaceutical agents. Methods Kromasil C18 was designated as the stationary phase and methanol to tetrahydrofuran to water (1∶24∶75) as the mobile phase; with the column temperature (250mm 4.6mm， 5μm) of 35℃ at a flow rate of 0.8 ml/min， the evaporation temperature of 100℃ and the flow rate of gas of 2.5 L/min. Results The limits of quantitation for ginkgolide A， B， C and bilobalide were 0.106， 0.104， 0.105 and 0.105 mg/ml， respectively. This method is linear over concentration ranges of 0.127 ～ 0.506， 0.129 ～ 0.548， 0.131 ～ 0.576 and 0.131 ～ 0.561 mg/ml for ginkoglide A， B， C and bilobalide， respectively (r&>0.999). The recoveries for ginkgolide A， B， C and bilobalide were 92.4%～100.8%. The coefficient of variation of intraday and interday precision was respectively less than 2% and 3% for all compounds. Conclusion The validated method is accurate and easy to handle， thus providing the basis for the quality control of EGb.
Key words: HPLC; ELSD; extract of Ginkgo biloba leaves; determination
银杏叶为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶，其提取物是经现代提取工艺从银杏叶中提取的活性物质，其主要活性化学成分为两大类：黄酮类及萜类［1］。银杏内酯是二萜类和倍半萜类内酯，二萜类内酯主要有银杏内酯A 、B 、C 、J、M等，倍半萜类内酯有白果内酯［2］ 。自20 世纪70 年代初发现了PAF 后，药理学家对银杏内酯进行了研究，证明银杏萜内酯是强血小板活化因子拮抗剂［3］ ，对免疫系统［4］ 、中枢神经系统、缺血损伤有保护作用，并有抗休克、抗过敏及抗炎作用［5］。国内外的药理学家对银杏内酯的药理作用及临床应用进行了大量的研究，银杏叶制剂在临床的应用也愈加广泛。
有关银杏内酯的体外检测方法很多，由于银杏内酯的低紫外吸收，同时存在的黄酮类物质有较强的干扰，不便使用紫外检测器［6-7］，质谱检测器由于其灵敏度高，不受化合物紫外吸收的限制，目前已成为银杏内酯体内外测定的主要检测器［8-12］，但由于其价格昂贵，限制了其使用。蒸发光散射检测器由于其灵敏度及选择性均较好，因此常常作为银杏内酯类成分测定的首选［13］，我国药典［14］即采用高效液相色谱结合蒸发光散射检测器对银杏叶提取物中内酯类成分进行质量控制。
本实验采用高效液相色谱结合蒸发光散射检测器同时测定银杏叶提取物及其制剂中4种内酯类化合物银杏内酯A、B、C以及白果内酯的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津制作所），包括SCL-10Avp System Controller， LC-10ADvp泵，FCV-10ALvp四元低压梯度洗脱系统，DGU-20A5在线脱气机，7725i进样器；HW2000 色谱数据工作站(南京千谱软件科技有限公司)；蒸发光散射检测器（ELSD-UM3000，上海通微科技有限公司）。自动双重纯水蒸馏器(型号SZ-93，上海亚荣生化仪器厂)，Ultrasonic Generator (型号H66MC，无锡超声电子设备有限公司)，梅特勒托利多AE240电子天平(十万分之一，瑞士Mettler Toledo)。
1.2 试药 甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司），四氢呋喃（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），水为双蒸水，其余试剂为分析纯。对照品银杏叶提取物（110866-200202）、银杏内酯A(100080-200306)、银杏内酯B(100081-200406)、银杏内酯C(110861-200606)、白果内酯(110860-200407)，均购自中国药品生物制品检定所。样品EGb A（20060725）、EGb B（20070213）、EGb C（20061278）、EGb D、舒血宁注射液分别购自徐州EH药业公司、浙江KEB药业公司、江苏YZJ药业公司、邳州FW生物科技有限公司、黑龙江珍宝岛制药有限公司。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18（大连依利特有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：35℃，进样量：20μL，流速0.8 ml/min；蒸发光散射检测条件：蒸发温度100℃，气体流量2.5 L/min；流动相为甲醇-四氢呋喃-水（1∶24∶75）。在此条件下银杏内酯A、B、C及白果内酯的保留时间分别为27、40、21、29min。色谱图见图1。
图1 对照品HPLC-ELSD色谱图
1.银杏内酯C ；2.银杏内酯；3.白果内酯；4.银杏内酯B
2.3 样品溶液的制备 取银杏叶提取物30 mg，精密称定，加水2 ml，置水浴中温热使溶散，加2%盐酸溶液1滴，用乙酸乙酯振摇提取4次（3 ml，2 ml，2 ml，2 ml），合并提取液，用5%醋酸钠溶液4 ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯2 ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次4 ml，分取水液，用乙酸乙酯2 ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至2 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 标准贮备液的配制 精密称取银杏内酯A、B、C、白果内酯对照品适量，用甲醇溶解并定容至5 ml棕色容量瓶中，摇匀即得含银杏内酯A 1.012 mg/ml、银杏内酯B 1.096 mg/ml、银杏内酯C 1.152 mg/ml、白果内酯1.122 mg/ml的混合对照品标准贮备液，4℃保存，备用。
2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系 精密量取“2.4”项下混合对照品标准贮备液1、0.6、0.5、0.4、0.25、0.2、0.16 ml，用甲醇-四氢呋喃-水溶液（1∶24∶75）分别稀释并定容至2 ml，得7个浓度的混合对照品溶液。按已建立的色谱条件，取各浓度对照品溶液分别进样20 μl分析，每个浓度点分别在实验开始、实验中间、实验结束时各进样1次，以浓度（x，mg/ml）对峰面积平均值（y）回归，得回归方程。结果表明，浓度与峰面积之间呈良好的线性关系。见表1。表1 线性关系实验结果
2.5.2 检测限和定量限 取“2.4”项下混合对照品标准贮备液，用甲醇-四氢呋喃-水溶液（1∶24∶75）依次稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液并进样分析，测定峰面积约为噪音10倍（S/N≥10）时的进样浓度为定量限（QOD），测定峰面积约为噪音3倍（S/N≥3）时的进样浓度为检测限（LOD），结果银杏内酯A、B、C、白果内酯的定量限分别为0.106、0.104、0.105、0.105 mg/ml，检测限分别为0.063、0.069、0.072、0.07 mg/ml。
2.5.3 回收率考察 精密称取已知含量的EGb A（批号：20060725）30 mg，分别加入“2.4”项下混合对照品标准贮备液80、100、120 μl（每个水平取样3份），按“2.3”项下样品处理方法进行处理，在“2.2”项色谱条件下进样分析，得4个成分3个浓度回收率的平均值及RSD（见表2）。表2 回收率实验结果
2.5.4 精密度考察 取EGbA，按“2.3”项制备供试品溶液，取该供试品溶液20 μl在“2.2”项色谱条件下连续进样6次，以峰面积计算，4个成分日内精密度（RSD）分别为1.5%、1.2%、1.1%、1.9%。取该供试品溶液20 μl在“2.2”项色谱条件下连续分析6天，每天进样1次，以峰面积计算，4个成分日间精密度（RSD）分别为2.2%、2.3%、2.5%、2.1%。
2.5.5 重现性和稳定性考察 取EGb A样品6份，按“2.3”项下制备供试溶液并在“2.2”项下色谱条件进行分析，4个内酯类成分色谱峰面积的RSD结果见表3。表3 重现性和稳定性实验结果
取EGb A的供试品溶液1份，室温下自然放置，分别在0、1、3、5、7、10 h取20 μl在“2.2”项下色谱条件进行分析，计算四个内酯类成分色谱峰面积的RSD，结果见表3。
2.6 实际样品的测定 取银杏叶提取物，按“2.3”项制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件进样20 μl分析，根据回归方程计算四个内酯类成分的含量，结果见表4。银杏叶提取物样品色谱图见图3。表4 银杏叶提取物中4种内酯类化合物含量测定结果
中国药典规定银杏叶提取物中内酯类含量的控制是将银杏内酯A、B、C及白果内酯的含量加和计算成总内酯的含量，并规定总内酯含量必须在6.0%以上，由实验结果可以看出各厂家生产的银杏叶提取物均符合药典标准，但徐州EH样品未检出银杏内酯C，舒血宁注射液未检出白果内酯。据文献报道银杏内酯C具有抑制血小板聚集因子，白果内酯具有神经保护作用，可见用总内酯含量并不能全面控制银杏叶提取物及其制剂的质量，因此，如何全面控制银杏叶提取物及其制剂的质量仍需进一步研究。
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