作者：戴夕超 韩正祥 杜秀平 张西志 汪步海
【摘要】 目的 探索双氢青蒿素对大鼠放射性肺损伤的防治作用。方法 采用γ射线单次全肺照射15 Gy，建立SD大鼠放射性肺损伤模型。108只同体重雄性SD大鼠， 随机分为3组（n=36）。正常对照组灌服等体积溶媒；单纯照射组灌服等体积溶媒＋全肺单次照射15 Gy；照射用药组灌服双氢青蒿素＋全肺单次照射15 Gy。双氢青蒿素和溶媒皆于照射前3天开始灌服，持续至照射后15天。双氢青蒿素灌服剂量为60 mg·kg-1·d-1。对各组大鼠的肺外观、肺组织中炎症渗出、胶原纤维生成状况进行观察和比较。 结果 照射用药组大鼠肺较单纯照射组肺表面光滑、弹性好、充血水肿表现轻。单纯照射组大鼠肺组织炎症渗出及纤维化征象最严重。结论 双氢青蒿素能够明显改善大鼠放射性损伤肺组织的炎性渗出，抑制胶原纤维的产生，减少血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，对放射性肺损伤具有一定的防治作用。
【关键词】 放射性肺损伤；双氢青蒿素；病理；大鼠
Abstract： Objective To investigate the effect of dihydroartemisinin on radiation-induced histopathological changes in the lungs in the animal model of rats. Methods 108 SD rats were randomly pided into 3 groups (n=36 each): normal control group (group C， drenching of solvent alone)， radiation control group (group R， drenching of solvent + single radiation of 15 Gy)， treatment group with dihydroartemisinin and radiation (group DR). The group R and DR were treated at the dose of 60 mg·kg-1·d-1). The group R and DR were radiated thorax with 60Coγ at the dose of 15 Gy/1 Fraction after chloralization. Drenching once a day began on the 3rd day before radiation until the 15th day after radiation. Changes of lung surface and histopathological were observed. Results After radiation， the swelling appearance， flexibility and hemorrhage of the lung surface of group DR were better than group R. By H-E and VG staining， the inflammatory effusion and fibrosis in group R were the severest， group DR was between the group C and R. By transmission electron miscroscope， the injury of type Ⅱ pneumonocytes and endothelial cells of capillary in R is worse than in DR. Conclusion Dihydroartemisinin may relieve inflammation and fibrosis in the radiation-induced pulmonary injury of rats， thus contributing to the prevention and treatment of radiation-induced pulmonary injury.
Key words: radiation-induced pulmonary injury; dihydroartemisinin; histopathological change; rat 放射性肺损伤(radiation-induced lung injury)是指临床上胸部肿瘤放射治疗时，临近的肺组织因受到的放射剂量超过其发生生物效应的阈值而产生的不同程度的肺损伤。这种并发症一旦发生，往往不可逆转，并且在一定程度上限制了放射治疗的剂量，影响到患者的治疗效果、预后和生活质量，严重者甚至危及患者生命，是发生非原发病因死亡的主要原因之一。
青蒿素(artemisinin)是中药青蒿的有效成分，是我国学者在1972年从青蒿全草中分离的抗疟有效成分、具有自主知识产权的一类新药，为含有过氧基团的新型倍半萜内酯，迄今仍是国际公认的最好抗疟药。新近研究还发现其具有放射增敏及抗炎、抗纤维化作用［1-3］，但未见其作用于放射性肺损伤的报道。本实验通过建立大鼠放射性肺损伤模型，早期应用双氢青蒿素进行干预，观察大鼠肺标本肺损伤组织病理学的变化，以寻求预防或治疗放射性肺损伤的有效途径，探讨双氢青蒿素对大鼠放射性肺损伤的防治作用。
1 材料和方法
1.1 动物分组及药物 清洁级SD大鼠108只，雄性，体重(250±20)g，徐州医学院实验动物中心提供，所有大鼠按随机数字表法随机分为3组：正常对照组36只（灌服等体积溶媒）、单纯照射组36只（灌服等体积溶媒＋单次全肺照射15 Gy）、照射用药组36只（灌服60 mg·kg-1·d-1双氢青蒿素＋单次全肺照射15 Gy），双氢青蒿素粉剂来自成都欧康植化公司，批号2006030508。
1.2 灌服方法 溶媒为植物油，双氢青蒿素溶于植物油中。双氢青蒿素和溶媒皆于照射前3天开始灌服，每日于相同时间点用药1次，持续至照射后15天结束。药物剂量根据预实验结果确定为灌服双氢青蒿素60 mg·kg-1·d-1。
1.3 照射方法 参考李绍东等［4］建立的放射性肺损伤模型，以60Co机产生γ线照射SD大鼠全肺。动物由10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，取仰卧位固定在自制放射板上，模拟机下定位，以双侧锁骨下到剑下突为照射区，一次性照射15 Gy，剂量率0.75 Gy/min， 源皮距75 cm。正常对照组相同麻醉但不照射。照射结束，待其苏醒后送返动物中心继续饲养。
1.4 标本制备 于照射后3、7、15、30、45、60天，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉实验组及相同鼠龄对照组大鼠，每组大鼠各6只。大体观察肺组织，留取右肺中叶进行病理组织学分析。取大鼠右中肺叶部分组织置10%中性甲醛溶液中固定24 h，常规脱水、浸蜡、包埋、切片(厚度4 μm)后，进行苏木素-伊红染色（H-E染色）及VG染色（Van-Gieson苦味酸酸性复红法），光镜下观察组织显微结构及肺胶原纤维。结果采用半定量判定。
1.4.1 H-E染色结果判定 根据Szapiel等［5］提供的方法确定肺泡炎程度：0级为无肺泡炎；1级为轻度肺泡炎，肺泡间隔因细胞浸润增宽，病变范围小于全肺的20％；2级为中度肺泡炎，病变范围占全肺的20％～50％；3级为弥漫性肺泡炎，病变范围超过全肺的50％。
1.4.2 VG染色结果判定 根据Szapiel等［5］提供的方法确定肺纤维化：0级为无肺间质纤维化；1级为轻度肺间质纤维化，受累范围少于全肺的20％；2级为中度肺间质纤维化，受累范围占全肺的20％～50％，肺泡结构紊乱；3级为重度肺间质纤维化，受累范围超过全肺的50％，肺泡融合，肺实质结构紊乱。
1.5 统计学处理 各组数据比较采用秩和检验。使用SPSS 11.5统计软件包进行统计学处理，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 实验动物临床表现 单纯照射组大鼠自实验第4周开始出现精神萎靡，食量下降，活动减少，对刺激反应迟钝，并呈下降趋势。自放疗约第4周出现胸部照射野毛发明显脱落，全身毛发光泽晦暗。照射用药组大鼠照射后也出现食量下降，毛发黯淡，严重程度与照射组无差别，但照射用药组大鼠精神明显好于单纯照射组。正常对照组大鼠整个实验过程精神、活动及食量均正常。
2.2 双氢青蒿素对放射性肺损伤大鼠常规组织学的影响
2.2.1 大体标本 正常大鼠肺呈均质粉红色，表面光滑，弹性好，无充血水肿；照射后3、7、15、30天可见鼠肺呈充血水肿，花斑状，不均质，随照射时间延长而明显；照射用药组比单纯照射组充血水肿表现轻。到照射后60天，单纯照射组鼠肺皱缩，表面不平，淤斑多见；照射用药组鼠肺呈红白相间，肺弹性尚好，皱缩程度、颜色深浅、淤斑数量均好于单纯照射组（图1）。图1 大体标本表现
2.2.2 H-E染色 ①正常对照组大鼠组织学正常，肺泡结构清晰，未见充血、出血及水肿。②照射后3、7天渐出现炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞，单纯照射组和照射用药组差别不大，但均比正常对照组炎症明显。随时间延长，炎性渗出呈加重趋势；至照射后15天炎性渗出比较明显，肺泡间隔见大量炎性细胞，肺组织多见充血、水肿，可见泡沫细胞，肺泡间隔稍增厚，肺泡腔变形；照射用药组比单纯照射组炎性渗出及充血水肿情况减轻，多为1级到2级肺泡炎(P&<0.01)，单纯照射组多为3级肺泡炎。照射后30天肺间质增厚，局部肺实变，肺泡腔缩小，有不同程度纤维母细胞增生，肺泡腔内大量纤维素渗出、水肿液、红细胞及成堆的泡沫细胞；照射用药组较单纯照射组明显减轻，未见肺实变，水肿及泡沫细胞少，多为2级肺泡炎(P&<0.05)。③照射后45、60天可见出血、充血情况减弱，少量纤维增生，肺泡壁增厚，局部实变和代偿性肺气肿、肺大泡，有红细胞、炎细胞、泡沫细胞、多核巨细胞渗出，肉芽组织增生。照射用药组较单纯照射组有所减轻，但无统计学意义（表1，图2）。表1 各组大鼠肺泡炎分级（H-E染色）
2.2.3 VG染色表现 ①正常大鼠肺组织VG染色可在脏层胸膜下、支气管、血管周围见少量呈粉红色显色的胶原纤维，肺纤维化分级皆为0级。②照射后3、7、15天胶原纤维显示未见明显变化，照射后30天脏层胸膜下、支气管、血管周围胶原纤维增多明显，照射用药组较单纯照射组减轻；但肺间质未见肺纤维化。③照射后45、60天脏层胸膜下、支气管、血管周围胶原纤维增多明显，肺间质出现胶原纤维增生，照射用药组较单纯照射组减轻，45天时多为1级肺纤维化，两组比较无统计学意义，60天时单纯照射组多为2级肺纤维化，照射用药组多为1级纤维化，2组比较有统计学意义（P&<0.05）（图3，表2）。图3 大鼠肺组织VG染色表现（×400）表2 各组大鼠肺纤维化分级（VG染色）与同时间点单纯照射组比较：**P&<0.01
双氢青蒿素(dihydroartemisinin)为青蒿素的衍生物，是青蒿素类药物的体内代谢物，其具有抗寄生虫、抗孕、抗心律失常、免疫双向调节等作用。最近的研究显示它对白血病、结肠癌、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统肿瘤及肾癌细胞有抑制作用，美国国立癌症研究所已将其立为抗癌药物筛选药物；目前已证明其具有减少肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等炎性介质释放的功能［2-3］；同时动物实验也表明青蒿素对实验性矽肺有明显的预防和治疗作用，阻抑肺胶原抗纤维化作用［6］ 。但青蒿素类药物能否应用于放射性肺损伤尚未见报道。
放射性肺损伤已经成为严重制约胸部肿瘤治疗的并发症。肺泡是放射性肺损伤的主要部位，前期基本病变为肺充血、水肿、肺间质增厚，后期肺损伤以肺泡间隔的进行性纤维化为特征，逐渐出现肺泡萎缩并由结缔组织填充［7］ 。目前认为细胞因子在介导放射性肺炎的发生方面起着重要的作用［8-9］。
本实验用60Co γ射线复制了放射性肺损伤2个月的模型，病理学检查示肺间质逐渐增厚到肺实变，炎性细胞渗出明显，主要为肥大细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞，肺水肿明显，且发现随着时间的延长胶原纤原逐渐增多。肺泡壁Ⅱ型细胞损伤脱落，Ⅱ型细胞线粒体肿胀，血管内皮细胞空泡样变、水肿、肺间质水肿，结果与白蕴红等［10］报道相同。为进行下一步的实验奠定了良好的模型基础。
放射性肺损伤病理变化一般分为4个时期：早期以渗出为主（0.5～1个月），中期改变以肉芽生长为主（2～3个月），后期改变以纤维增生为主（3～6个月），晚期改变以胶原化病变为主（6个月以后）［11］。我们建立的模型属于早、中期改变，但是各期之间无明显界限。实验显示单纯照射组在照射后3天，有炎性细胞渗出，15、30天时炎症纤维素样物和炎性细胞渗出明显导致肺水肿，以及从而导致中晚期的肺纤维化、实变等；而照射用药组在15、30天时炎性细胞渗出较单纯照射组减少，水肿及纤维素样物渗出减轻，60天时胶原纤维亦较单纯照射组减少，说明双氢青蒿素能有效地减轻炎性渗出，从而减少胶原纤维的形成。肺血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞是放射引起损伤的靶细胞［12］ 。照射后Ⅱ型细胞数早期减少，后期增生。Ⅱ型肺泡上皮细胞在肺中至少有2个重要功能：合成和分泌肺泡表面活性物质，对维持肺泡稳定性起到作用；在Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤时由Ⅱ型肺泡上皮细胞分裂、分化和再生加以修复。在修复过程中， 毛细血管再生， 肺泡Ⅰ型上皮细胞由Ⅱ型上皮细胞替代。如果损伤累及细胞外基质成分， 则毛细血管三维结构的正常重建受阻， 瘢痕形成。
双氢青蒿素能够明显改善大鼠放射性损伤肺组织的炎性渗出，抑制胶原纤维的产生，对放射性肺损伤具有一定的防治作用。
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