【摘要】 目的 研究腹透液相关浓度葡萄糖（1.5％、2.5％）对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白p21的影响及葛根素的拮抗作用。方法 人腹膜间皮细胞在含糖（1.5％、2.5％）、含糖含葛根素(葛根素终浓度为100 mg/L)的无血清培养基中培养24 h后，用流式细胞仪分析细胞周期，Western blot测定p21蛋白的表达。结果 经含糖1.5％和含糖2.5％培养基培养24 h后人腹膜间皮细胞大多出现肥大和停滞于细胞周期的G1期。高浓度葡萄糖刺激p21蛋白表达，含糖2.5％组和含糖1.5％组无显著性差异(P&>0.05)。含葛根素含糖组腹膜间皮细胞中处于G1期细胞数较相应浓度含糖组减少，p21表达减少(P&<0.05)。结论 高糖可刺激人腹膜间皮细胞p21蛋白的表达，且可能与高糖作用下细胞肥大及G1期阻滞有关，葛根素可在一定程度上拮抗高糖对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白的影响。
【关键词】 腹膜间皮细胞;葡萄糖;细胞周期蛋白；葛根素
Abstract: Objective To investigate the effect of glucose at different concentrations on the cell cycle and p21 expression in cultured human peritoneal mesothelial cells (HPMC) and protection of puerarin. Methods HPMCs were cultured with serum free RPMI 1640 medium containing glucose of different concentrations (1.5% and 2.5%) and puerarin (100 mg/L) for 24 hours. The cell cycle distribution was then investigated by flow cytometry. The expression of p21 was detected by Western blot. Results In the presence of 1.5% and 2.5% glucose concentrations， most of the cells became hypertrophic， and were arrested in G1 phase of cell cycle. High glucose stimulated expression of p21， which had no difference between the 1.5% and 2.5% (P&>0.05). The number of the cells arrested in G1 and p21 expressions decreased in groups of puerarin. Conclusion High glucose stimulated the expression of p21， which might be related to the hypertrophy and arrest in the G1 phase of mesothelial cells by high glucose. Puerarin might antagonize the effect of high glucose of the cycles of mesothelial cells and their cyclin.
Key words: peritoneal mesothelial cells; glucose; cyclin; puerarin
腹膜纤维化所致的腹膜功能衰竭是腹膜透析应用受限的主要原因。研究发现高糖可使间皮细胞肥大，间皮细胞层受损或缺失，导致腹膜纤维化和功能丧失［1］，有效保护腹膜间皮细胞能延缓腹膜纤维化。细胞周期调控蛋白p21过度表达与细胞肥大有关［2-3］。葛根素能拮抗腹膜透析液对腹膜间皮细胞的损伤，发挥抗纤维化作用［4］。本实验观察高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞周期和p21蛋白的影响及葛根素的拮抗作用，从细胞周期和周期蛋白角度探讨葛根素抗腹膜纤维化的分子机制。
1 材料和方法
1.1 材料 含糖腹膜透析液购于广州百特公司，葛根素为浙江康恩贝制药股份公司产品，血清、RPMI1640粉剂、胰酶购自GBCO公司，抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体、抗p21抗体购自北京中山生物技术有限公司，流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。
1.2 方法
1.2.1 人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定 取非尿毒症和糖尿病择期手术患者的网膜作为细胞来源，按文献［5］法培养间皮细胞。当细胞生长融合时用胰酶消化，按1∶3传代，第3代用于实验。经倒置显微镜观察和免疫组化抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体染色阳性，抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性鉴定。
1.2.2 间皮细胞分组及在不同条件下的形态观察 将融合后的腹膜间皮细胞消化后接种于6孔培养板中，培养至亚融合后加入无血清RPMI1640培养基，同步化培养24 h后分别加入含不同浓度葡萄糖（1.5%、2.5%）和（或）葛根素(葛根素终浓度为100 mg/L)的培养基中培养24 h，在倒置显微镜下观察细胞形态。实验分对照组（不含糖不含葛根素）、含糖1.5％组、含糖2.5％组及葛根素组、含葛根素含糖1.5％组、含葛根素含糖2.5％组6组。
1.2.3 流式细胞仪分析各组间皮细胞的周期分布 腹膜间皮细胞在不同条件培养基中培养24 h后用PBS液洗2次，胰酶消化，70%乙醇固定后，重悬于PBS液中。加入RNA酶50 mg/L，避光30 min离心去上清液。碘化吡啶于暗处染色30 min后，用流式细胞仪检测，得到细胞周期各时相百分比。
1.2.4 Western blot检测不同浓度葡萄糖及葛根素作用下间皮细胞的周期蛋白 用RAPA裂解液提取细胞总蛋白，取40 μg样品经煮沸5 min后进行10%、15%的SDS-PAGE电泳，采用电转印法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，膜在室温封闭4 h，加1∶100抗p21抗体，4℃过夜，后加二抗室温作用1 h，洗膜后显色。
1.3 统计学处理 数据采用±s表示，用SPSS 12．0统计软件对所得数据进行分析，各组腹膜间皮细胞p21表达的比较采用单因素方差分析，P&<0.05表示存在显著性差异。
2 结 果
2.1 各组人腹膜间皮细胞周期的比较 对照组培养24 h的间皮细胞中G1期细胞比例为（62.5±3.3）%，而含糖1.5％组和含糖2.5％组G1期细胞比例增高，分别为（72.1±3.54）%和（72.5±3.4）%，与对照组有显著性差异(P&<0.05)，含糖2.5％组和含糖1.5％组无显著性差异（P＞0.05）。含葛根素含糖1.5％组和含葛根素含糖2.5％组G1期细胞比例分别为（64.7±4.5）%和（65.6±4.3）%，与对照组之间无显著性差异（P＞0.05）。
3 讨 论
腹膜透析作为有效的肾脏替代治疗方法已经被越来越多的尿毒症患者所接受，腹膜发生纤维化导致腹膜功能衰竭是患者退出治疗的主要原因之一。含糖的腹膜透析液具有明显的生物不相容性，其导致腹膜间皮细胞损伤被认为是腹膜纤维化的关键因素［6］。有效保护腹膜间皮细胞可明显延缓腹膜纤维化的进程。
在长期腹膜透析过程中腹膜间皮细胞可因持续暴露于高糖腹膜透析液中而出现细胞肥大、细胞分裂停滞等表现。在本实验中我们也发现高浓度葡萄糖促使间皮细胞停滞于细胞周期的G1期。目前认为细胞肥大可能是由于细胞受细胞内外信号刺激后进入G1期时，DNA合成被抑制，同时蛋白和RNA 合成增加，细胞生长停滞于G1期所致［7］。细胞周期抑制蛋白p21能广泛抑制G1期和S期的周期素与细胞周期激酶结合，使G1期过度延长，细胞增殖抑制，细胞呈肥大状态。
研究表明葛根素可以通过抑制氧化应激对腹膜间皮细胞产生保护作用［4］，但葛根素可否拮抗高糖对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白的影响尚不明确。我们检测不同浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞p21表达的影响，发现高浓度葡萄糖可刺激腹膜间皮细胞p21的表达，而含糖含葛根素组细胞较相应浓度含糖组p21表达减少。本研究提示高糖状态下间皮细胞形态学的改变可能与细胞周期的调控失衡有关，葛根素可拮抗上述影响，此结果为葛根素抗腹膜纤维化的分子机制提供理论依据。
综上所述，高糖可使腹膜间皮细胞停滞于G1期，可刺激腹膜间皮细胞p21蛋白的表达，葛根素可在一定程度上拮抗高糖对间皮细胞周期和周期蛋白的影响。由此推测，葛根素可能通过拮抗高糖对间皮细胞周期和周期蛋白的影响而保护腹膜间皮细胞，从而发挥抗腹膜纤维化的作用。
参考文献
［1］ Gotloib L， Shostak A， Wajsbrot V， et al. High glucose induced a hypertrophic， senescent mesothelial cell phenotype after long in vivo exposure ［J］. Nephron，1999，82(2):164-173.
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［3］ Kuan CJ， al-Douahji M， Shankland SJ. The cyclin kinase inhibitor p21WAF1， CIPl is increased in experimental diabetic nephropathy: potential role in glomerular hypertrophy ［J］. J Am Soc Nephrol，1998，9(6):986-993.
［4］ 蒋春明，张 苗，孙 诤.葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研究［J］.东南大学学报：医学版，2007，26(3):185-188.
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［6］ Pollock C. Pathogenesis of peritoneal sclerosis ［J］. Int J Artif Organs，2005，28(2):90-96.
［7］ Shankland SJ. Cell cycle regulatory proteins in glomerular disease ［J］. Kidney Int，1999，56(4):1208-1215.