【摘要】 目的 利用分子生物学技术，构建胸苷激酶基因（TK）自杀基因并测定其结构，为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础。方法 以人类单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV1） 基因组 DNA为模板，利用聚合酶链反应（PCR）法，扩增出约为1100 bp TK 基因，定向克隆到载体 PEGM-T，构建克隆载体。两端分别引入限制性内切酶Not Ⅰ、XholⅠ酶切位点，经 PCR 及酶切鉴定初步证实为重组体后，测序认证。结果 经 PCR、酶切鉴定和测序鉴定完成 TK 基因的构建，同源性高达98.70%，完全具备表达该目的基因的要求。结论 成功扩增出 TK 基因，为继续研究打下基础。
【关键词】 TK基因 自杀基因 聚合酶链反应
Abstract： Objective To construct the suicide gene herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV-TK) and to sequence its structure for identification. Methods The TK gene fragment was amplified by PCR from the genome DNA of herpes simplex virus. The PCR product was cloned to the vector PEGM-T. The interested TK gene fragment in the recombinant plasmid obtained was confirmed by PCR， enzyme digestion and sequencing. Results The TK gene was successfully obtained. The product was 98.70% original. Conclusion The construction of TK gene may help start the research into the suicide gene strategy for the control of cancers.
Key words: thymidine kinase; suicide gene; polymerase chain reaction (PCR)
将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒或低毒的前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为“自杀基因”［1］。肿瘤的自杀基因疗法首创于 1986 年，为目前研究的热点， 其中研究最多的当属单纯疱疹病毒胸苷激酶 HSV - TK 基因。本实验构建了TK 基因，以期为进一步研究自杀基因系统的抗肿瘤机制及各种肿瘤基因治疗作用打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料 本实验克隆载体PEGM-T 购自Promega 公司；病毒株为人类单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV1）作为TK基因模板抽提病毒，购自武汉中国病毒库；大肠杆菌JM109作为宿主菌，由徐州医学院病理学教研室提供。主要试剂盒和实验试剂：PCR 扩增试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶为Fermentas 公司产品，核酸分子标准品（DL1500 Marker）、DNA marker (Lambda-pUC Mix Marker)为 Takara 公司产品，特异性引物TK 基因引物按照《分子克隆实验指南》引物设计原则，并且加入特定的酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成。
上游引物：P1 5′-TAGCGGCCGCATGGCTTCGTACCCCTGCCATC-3′
NotⅠ
下游引物：P2 5′-GCCTCGAGGTTAGCCTCCCCCATCTC-3′
XholⅠ
1.2 方法
1.2.1 HSV1基因组 DNA 的抽提 HSV1加入50 ml LB 液，250 r/min 37℃摇菌过夜。上海生工生物工程有限公司基因组DNA 分离纯化试剂盒用于提纯基因组DNA（按操作说明书进行）。
1.2.2 PCR 扩增目的基因片段 以HSV1基因组 DNA 为模板进行PCR 扩增。50 μl PCR 反应体系中含HSV1 基因组 DNA 模板 3.0 μl，dNTP 2.0 mol/L 5 μl， MgCl2 1.0 mol/L 2 μl，引物各为5 pmol，Tag 酶0.5 μl。反应参数：94 ℃预变性5 min 后，94 ℃ 变性60 s，56 ℃退火90 s，72 ℃延伸75 s，35个循环后，72 ℃ 最终延伸20 min。
1.2.3 TK基因的全序列测定 取含TK基因片段的PCR扩增产物 50 μl，1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化TK基因（1100 bp）。取纯化产物3 μl 加入载体 PGEM-T 1 μl，在 T4DNA 连接酶作用下，18℃ 连接过夜，构建PGEM-T-TK 重组质粒。取连接产物转化感受态细胞大肠杆菌 JM109 后，接种 Amp 抗性、IPTG、x-gal 琼脂培养皿，利用蓝白斑菌显色，挑选阳性重组子。取阳性克隆菌落，摇菌过夜，提纯质粒后，分别用T 及 SP6 通用测序引物从两端测定基因全序列（委托上海生工生物工程有限公司测序），Omega 基因分析软件进行基因序列分析。
2 结 果
2.1 PCR扩增结果 经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定表明，TK基因片段约为1100 bp，扩增的片段大小与预计一致。见图1。
图1 TK基因的PCR扩增图
M为Marker，TK为编码胸苷激酶（TK）的基因
2.2 重组质粒的酶切鉴定 重组质粒PEGM-T-TK经NotⅠ、XholⅠ酶切，切出片段约分别为1100 bp、3000 bp，与预计大小一致。见图2。
M为Marker，1为PEGM-T载体（3000 bp），2为TK基因（1000 bp）
2.3 测序结果 分别用 T7 及 SP6 通用测序引物从两端测定基因全序列，以达到测通目的基因全部碱基序列的目的。利用 DNAStar分析软件与GenBank提供的 TK 基因序列对比，同源性高达98.70%。
3 讨 论
TK基因是编码胸苷激酶的基因，病毒、细菌、真核细胞及其线粒体内均存在TK基因。不同来源的TK基因结构及其蛋白产物的分子大小、理化性质和生化功能均不同。肿瘤基因治疗中，常用的有单纯疱疹病毒(HSV)和水痘带状疱疹病毒(VZV)的TK基因。
HSV1-TK/GCV系统治疗恶性肿瘤是研究最广泛的自杀基因治疗方法之一。HSV载体携带胸苷激酶基因（TK基因），进入肿瘤细胞并表达HSV-TK基因，HSV-TK基因编码胸苷激酶活化后，使抗病毒药物丙氧鸟苷（GCV）三磷酸化，抑制癌细胞的DNA聚合酶活性；或代替Dtp渗入到细胞DNA中，抑制DNA聚合酶并掺入DNA合成链中，引起链中止、染色体变性和姐妹染色单体交换，使癌细胞的DNA、蛋白质合成受到抑制，肿瘤细胞死亡，从而达到治疗癌症的目的。 因此， 细胞增殖越快， 则GCV对其作用越明显［２］。此外，由于HSV-TK/GCV存在旁观者效应而扩大对肿瘤细胞的杀伤效应。Kuriyama等［３］用HSV-TK基因转染肝癌细胞，不仅转染了HSV-TK基因的肝癌细胞大量死亡，而且周围大量未转染的肝癌细胞亦有大量死亡的现象，其机制可能与细胞间连接有关。HSV-TK/GCV系统还可以通过诱导机体免疫反应，使肝癌周围组织中CD4（+）和 CD8（+）T淋巴细胞大量浸润，从而抑制肝癌细胞增殖。
基于目前国内外的研究现状，TK 基因引物是［4］根据《分子克隆实验指南》引物设计的原则 ，利用GenBank 发表的DNA 序列上下游分别截选一段核苷酸序列所成，并在上、下游引物中加入目的片段和载体中没有的特异的酶切位点NotⅠ、XholⅠ，利用酶切鉴定。
进行DNA 重组重要的是解决目的基因的获得和如何将目的片段进行适当连接两个关键问题。采用 PCR方法从含有目的基因的人类单纯疱疹病毒基因组中扩增出目的基因片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段，回收需要的目的基因片段，通过载体特有的T 末端和PCR 扩增目的片段两端形成的 ployA尾巴，用 DNA 连接酶进行连接，得到了克隆质粒。
【
参考文献
】［1］ Moolten FL. Tumor chemosensitivity conferred by inserted herpes thymidine kinase genes：paradigm for a prospective cancer control strategy［J］．Cancer Res， 1986，46（10）：5276-5281.
［2］ Sung MW， Yeh HC， Thung SN， et al. Intratumoral adenovirus-mediated suicide gene transfer for hepatic metastases from colorectal adencarcinoma:results of a phase I clinical trial［J］. Mol Ther， 2001，4(3): 182-191.
［3］ Kuriyama S， Masui K， Kikukawa M， et al. Complete cure of established murine hepatocellular carcinoma is achievable by repeated injections of retroviruses carrying the herpes simplex virus thymidine kinase gene ［J］. Gene Therapy， 1999， 6(4): 525-533.
［4］ 萨姆布鲁克·J，拉塞尔·DW. 分子克隆实验指南［M］. 第2版. 北京：科学出版社，2002:679-684.
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