作者：戴园园 袁宝强 魏海燕
【摘要】 目的 了解不同年龄大鼠癫疒间持续状态后外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对海马齿状回颗粒细胞层神经发生的影响。方法 建立14天大鼠和60天大鼠戊四氮(PTZ)诱导癫疒间持续状态模型，生理盐水（NS）注射作为对照，皮下注射bFGF进行干预，分4组：NS组、NS+ bFGF组 、PTZ组、PTZ+ bFGF组。采用Brdu标记新生细胞，免疫组化方法检测造模后大鼠海马齿状回神经发生情况，造模后第7、14天2个时间点观察海马齿状回Brdu阳性细胞数。结果 造模后第7天和14天，PTZ组中各日龄组大鼠海马齿状回Brdu阳性细胞数明显高于各自对应的NS组(P&<0.01)，NS+bFGF组各日龄大鼠Brdu阳性细胞数亦高于NS组(P&<0.05)， PTZ+bFGF组Brdu免疫阳性细胞数较PTZ组亦有升高(14天日龄组P&<0.05，60天日龄组P&<0.01)。60天大鼠较14天大鼠升高幅度更为明显(P&<0.01)。结论 bFGF可增加癫疒间持续状态大鼠海马齿状回颗粒细胞发生，对60日龄大鼠比14日龄幼鼠更为明显。
【关键词】 癫疒间持续状态 碱性成纤维细胞生长因子 神经发生 齿状回
Abstract: Objective To study the neurogenesis of hippocampal dentate gyrus granular cell layer in different-age rats with induced status epilepticus and its response to ectogenic basic fibroblast growth factor (bFGF). Methods Pentetrazole (PTZ) was used to form status epilepticus model on 14-day and 60-day old rats. The experiment was carried out in four groups， with the results analysed 7 days and 14 days after treatment. Brdu labeled new cells were counted to describe the neurogenesis in dentate gyrus. Results 7 days and 14 days after treatment， Brdu positive cells in the dentate gyrus were more numerous in the PTZ group and the NS+bFGF group than in the NS group， more numerous in the PTZ+bFGF group than in the PTZ group (P&<0.01， P&<0.05）. The increment was more marked in the 60-day-old rats than in the 14-day-olds. Conclusion Basic fibroblast growth factor can promote neurogenesis in the hippocampus dentate gyrus granular cell layer in rats with status epilepticus， and the change is more marked in the elder rats than in the younger.
Key words: status epilepticus; basic fibroblast growth factor; neurogenesis; dentate gyrus
癫疒间是神经系统常见疾患，发作后海马齿状回可发生多种可塑性变化，包括轴索重组、星形胶质细胞活化、树突重组和颗粒细胞的神经发生(neurogenesis)等。神经发生是指包括人在内的大多数哺乳类动物均存在的神经系统产生新神经元的过程。近年来，已有研究证实癫疒间发作后海马齿状回颗粒细胞层的神经发生增加［1－2］。海马齿状回颗粒细胞层的神经发生受到多种生长因子和神经营养因子的调控，其中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)是较重要的一种。本试验即给予外源性bFGF皮下注射，探讨bFGF是否促进大鼠癫疒间发作后海马齿状回颗粒细胞层神经发生，并探讨年龄因素对于癫疒间发作后这一可塑性变化有无影响。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 生后14天和60天的SD大鼠 ，分别随机分为癫疒间持续状态组（PTZ组）、 生理盐水组（NS组）、 bFGF干预癫疒间持续状态组（PTZ+ bFGF）和bFGF干预生理盐水组（NS+ bFGF组）。
1.2 模型的建立 PTZ组和PTZ+ bFGF组给予腹腔内注射1％戊四氮(PTZ，Sigma公司) 80 mg/kg， 用双蒸水稀释成10 g/L，腹腔注射；NS组、NS+ bFGF组给予腹腔注射等体积生理盐水。NS+ bFGF组和PTZ+ bFGF组在注射戊四氮或生理盐水前2 h皮下注射bFGF（Sigma公司）20 μg/kg （用生理盐水稀释成1 mg/L）。PTZ组和PTZ+bFGF组中除去无发作和死亡者，每组入组6只。
参照Racine癫疒间发作分级标准［3］:0级，无任何发作;1级，口、面部抽搐;2级，节律性点头样运动;3级，前肢阵挛;4级，前肢阵挛伴后肢站立;5级，反复的4级发作或抽搐致死。PTZ组和PTZ+ bFGF组入组大鼠均达到3~5级发作，持续30 min以上，发作间期意识无清醒，呈癫疒间持续状态。发作1 h以上者给予地西泮4 mg/kg腹腔注射中止发作。
1.3 Brdu注射 Brdu（Sigma公司）溶于生理盐水，浓度10 g/L。注射戊四氮或生理盐水后第6、13天各组经腹腔注射Brdu，剂量为50 mg/kg，每2 h 1次，共4次。
1.4 组织切片制备 各组分别于注射Brdu后24 h腹腔注射10％水合氯醛（0.35 ml/kg）麻醉。生理盐水快速灌注后，含4％多聚甲醛的PBS先快速灌注再缓慢灌注，直到大鼠肝脏变白、尾变硬，停止灌注。开颅，取嗅脑至中脑之间的脑组织，放入4%多聚甲醛固定12 h以上，然后依次移入20%和30%蔗糖中4℃过夜至沉底。在海马部位做冠状冰冻切片，每隔2张取1张切片，每例标本(双侧海马结构)取切片不少于8张，进行免疫组化染色。
1.5 Brdu免疫组化 应用SP免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物公司）， 按以下步骤处理:脑片入新配制的0.1%h3O2溶液中室温下孵育30 min以灭活内源性过氧化物酶; 入2 mol/L HCl溶液中，37℃ 浸泡60 min使DNA变性，再用0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH 8.5)室温下浸泡10 min用以中和盐酸；然后以鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体（1∶100，北京中杉金桥生物公司）作为一抗， 采用SP法行Brdu免疫组织化学染色， 用DAB和h3O2 呈色， 自来水冲洗， 贴片、 脱水、 透明、 封片。 胞核棕黄色为阳性细胞。
1.6 图像分析 切片置于Olympus PM-CB显微镜下观察，在高倍镜下观察整片大鼠海马齿状回颗粒细胞层(GCL)、亚颗粒增生带(SGZ，CL与门区之间约2个细胞体厚的1层)及门区的Brdu阳性细胞数，每只大鼠随机取5~6个非连续脑片进行计数，取平均值。
1.7 统计学处理 数据由SPSS 11.5统计软件处理，x±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及t检验，检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 行为学观察 PTZ组、PTZ+bFGF组：注射戊四氮后经过1～4 min的潜伏期，大鼠由自由活动状态逐渐转为安静，眼神呆滞，出现咀嚼运动、流涎、扒地、搔抓动作，双后肢分开站立，继之进入大发作期，出现前肢痉挛、狂奔，跳跃、嘶叫、头偏向一侧及全身阵发性抽动；部分动物表现为摔倒、翻滚等全身强直－阵挛性发作，同时伴有喉鸣、肢端青紫等。入组动物发作均超过30 min，发作超过1 h者经注射地西泮后逐渐缓解。发作停止后，动物经约1 h安静状态后活动渐恢复。
NS组、NS+bFGF组：无任何发作迹象和抽搐表现，行为正常。
2.2 碱性成纤维细胞生长因子对海马神经发生的影响 造模后第7天和第14天，2个日龄组中NS+bFGF组Brdu阳性细胞数较各自NS组增多（P&<0.05），PTZ各组日龄的大鼠Brdu阳性细胞数明显高于各自的NS组（P&<0.05），同时PTZ+bFGF组较PTZ组亦明显升高（P&<0.05）。
造模后第7天，4组大鼠的大部分Brdu阳性细胞分布于颗粒细胞下层(图1A、C)；第14天，新生细胞在PTZ组和PTZ+bFGF组除分布于颗粒细胞层外，另有一部分迁移到门区和内分子层（图1B、D）。而在NS组和NS+bFGF组，Brdu阳性细胞主要分布于整个颗粒细胞层（图1E）。
新生细胞在由颗粒下层向颗粒细胞层迁移的
过程中， 胞核变大， 形状更接近圆形或卵圆形（图1F）。
图1 大鼠海马齿状回Brdu免疫反应产物(SP法)
A：PTZ组发作后7天，Brdu阳性细胞大部分分布在颗粒细胞下层（×100）； B： PTZ组发作后14天， Brdu阳性细胞除大部分布于颗粒细胞层外，还有部分分布在门区和内分子层（×100）；C：PTZ+ bFGF组处理后7天，Brdu阳性细胞大部分分布在颗粒细胞下层（×100）；D：PTZ+ bFGF组处理后14天，Brdu阳性细胞除大部分布于颗粒细胞层外，仍有部分分布在门区和内分子层（×100）；E： NS+bFGF组处理后14天， Brdu阳性细胞主要分布于整个颗粒细胞层（×100）；F：Brdu阳性细胞（×400）。表1 不同日龄大鼠各组齿状回Brdu阳性细胞数比较
3 讨 论
1992年，Reynold和Weiss证明成年哺乳动物的大脑内存在有神经发生现象［2］，主要部位在侧脑室下区和海马，海马齿状回下颗粒层增生带的祖细胞可以在细胞层和门区的边界增殖后迁移到颗粒细胞层并分化为成熟神经元。在动物实验中， 化学致惊剂诱导的颞叶癫疒间或是癫疒间持续状态所致的齿状回细胞增殖至少要经过数天的潜伏期，而神经元发生的高峰通常在癫疒间发作后1周左右［4］。我们前期的实验已证明幼鼠癫疒间持续状态后海马齿状回细胞有显著的神经发生现象，这种神经元生成增加提示在损伤部位可能有代偿作用［5］。
神经细胞的增殖和新生神经元的存活受到许多因素的影响，包括年龄、激素水平及多种生长因子等。其中bFGF对于脑损伤后的修复作用正受到越多学者的关注。 bFGF长期以来一直被认为是一种神经胶质细胞有效的有丝分裂原，能改善神经细胞的生长过程， bFGF可以改善海马结构、脑皮质、小脑的颗粒层神经细胞的存活和生长。在正常状态下，海马有一定的bFGF基础表达，癫疒间发作后脑内海马区bFGF表达显著增加［6］，提示中枢神经系统损伤局部环境存在自我修复，但这种因素短暂而不稳定。体内bFGF含量极微，病理情况下，内源性bFGF作用有限，外源性bFGF可以及时补充内源性bFGF的不足，早期应用可限制神经元损害的扩大。体内外实验证明，bFGF可以通过血脑屏障进入神经系统［7］，并且 bFGF在生物进化上有很强的保守性，人和牛bFGF氨基酸顺序同源性达98.7％，这为临床利用外源性bFGF进行替代补充治疗提供了基本依据。
有实验显示，在胎儿海马C3区移植物进行移植替代癫疒间持续状态后丢失的神经元时，经过bFGF预处理的细胞存活时间延长，且和成年海马显示出较好的整合作用并减轻了异常的苔藓纤维发芽［8］ 。Zucchini等［9］应用红藻氨酸点燃模型发现小鼠癫疒间发作后bFGF mRNA和蛋白的水平在某些脑区升高，给予侧脑室注射低剂量bFGF可以减轻海马的损伤，促进行为的恢复。
bFGF 促进大鼠海马齿状回的神经发生机制尚不十分明确，可能和以下有关:bFGF 诱导及促进神经前体细胞细胞核有丝分裂［12］，调节神经元前体细胞端粒酶活性［13］，调控钙调蛋白基因、血小板凝血酶敏感蛋白1 基因、特异性成骨细胞因子2 基因和细胞因子诱导的核蛋白的表达［14］。
癫疒间发作后存在神经细胞丢失，严重癫疒间发作后脑部的病理损害可累及多个脑区，其中海马区的细胞减少密度最为明显，损伤区周围的星形胶质细胞被激活，能够产生包括bFGF在内的各种细胞生长因子和神经营养因子，有利于神经元的生存和轴突再生，但保护作用是有限的。当脑损伤较重，或损伤时间长，保护作用则相对较弱。我们的实验采用了癫疒间持续状态模型，虽然癫疒间大鼠发作后神经元增殖增加，但仍逊于bFGF干预的癫疒间大鼠，这就提示内源性bFGF等因素所致的增殖代偿能力是有限的。外源性加入bFGF改变细胞再生环境，调控星形胶质细胞至一个恰当的状态，创造出一个有利于神经功能恢复的微环境。
严重的癫疒间发作会出现认知功能障碍，尤其在儿童，而神经发生现象和空间的学习、记忆能力有密切关系。bFGF在脑损伤后是一种极其重要的调节海马神经发生的因子。在脑损伤后给予外源性生长因子可以提供一个治疗方面的策略。
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