作者：周晓彤 沈振亚 滕小梅 夏漫辉
【摘要】 目的 探讨小鼠动脉血管内皮细胞分离、培养的方法，为进一步实验研究提供相应的技术手段。方法 手术显微镜辅助下取小鼠主动脉，去除外膜及脂肪组织，将血管剪成1 mm×1 mm大小的组织块，用植块法在含20% 胎牛血清的DMEM培养液中培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征，免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor，vWF）鉴定。结果 60 h后，相差显微镜下可观察到内皮细胞从组织块边缘游出，12天左右细胞开始融合成片，免疫染色相关抗原检测呈阳性。结论 用组织块培养方法可以获取较为满意的小鼠血管内皮细胞。
【关键词】 小鼠 血管内皮细胞 原代培养
Abstract： Objective To develope an efficient protocol for the isolation and culture of vascular endothelial cells from mouse aorta. Methods The aorta was removed from mice under an operation microscope， with the periadventitial fat and connective tissue cleared of carefully. The vessel was opened longitudinally and cut into small 1 mm×1 mm cubes. The cubes were placed on six-well plates with the intima side down and covered with a little DMEM containing 20% fetal bovine serum. The cell growth was evidenced by revealing the morphological characteristics and immunological marker VIII factor (or von Willebrand factor， vWF). Results Endothelial cells were found migrate out of the aortic cube after 60 h， forming confluent monolayer of a cobblestone pattern when observed under inverted phase-difference microscope about 12 days later. Immunohistochemical labeling showed the characteristic positive reaction to vWF in the cytoplasm of the new cells. Conclusion A reliable method is described to isolate and propagate vascular endothelial cells from mouse aorta by cultivating small tissue cubes.
Key words: mice；vascular endothelial cells； culture
在异种器官移植中，移植物血管内皮细胞是受体血流首先接触的组织，也是受体抗体攻击的主要靶细胞［1］。在受体免疫系统作用下移植物血管内皮细胞激活，在自身损伤的同时也释放一系列细胞因子和黏附分子等，最终导致移植物失活［2］。因此，血管内皮细胞在异种移植排斥反应中起着重要的作用。我们利用植块培养的方法，成功地培养出小鼠血管内皮细胞并传代，为进一步研究血管内皮细胞的功能并探索有效的血管内皮细胞保护方法建立了可靠的技术平台。
1 材料和方法
1.1 实验材料 体重20～25 g的昆明种小鼠（苏州大学实验动物中心），DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、Trypsin-EDTA（均为美国Gibco公司产品），EnVisionTM 两步法试剂盒（上海基因科技有限公司），YZ20T-Ⅲ手术显微镜 （苏州医疗器械厂）、CA950-2超净工作台（上海净化仪器厂）、CO2细胞培养箱 （德国Heraeus公司）、Eclips TS 100倒置相差显微镜（日本Nikon公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 内皮细胞的分离和培养 将小鼠颈椎脱臼处死，置入75%的乙醇中浸泡消毒1 min，操作台铺无菌巾，将小鼠置操作台上并固定。胸腹正中切口逐层切开，显露整个胸腹腔，于脊柱左侧找到主动脉，10倍手术显微镜下解剖主动脉弓，于左锁骨下动脉远侧的主动脉壁上做一小切口，置入导引钢丝直至髂动脉处，在钢丝引导下仔细分离动脉被膜及周围脂肪组织，切断其在胸腹腔的分支血管，完整取出胸、腹主动脉，并立即放入含DMEM培养液的培养皿中，移至超净工作台。在含有PBS液的无菌容器中反复冲洗血管3～4次，再放入另一无菌培养皿中，纵行剖开血管，用显微器械将其剪成1 mm×1 mm大小的血管植块，将血管内面贴在6孔板上，约1 cm2放1个植块。37℃、5% CO2培养箱中静置30 min后加入含20% FBS的DMEM培养液（pH值为7.2），加液量以略超过血管内膜面为宜，过多会导致血管植块漂浮，继续放入CO2培养箱中培养。60 h左右观察细胞生长情况，将血管植块除去，换液1次。以后每2天换液1次，待细胞融合成单层铺满孔底后进行传代培养：将6孔板移至超净工作台，吸弃培养液，用PBS液轻洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.2% EDTA混合消化液，倒置显微镜下观察，当细胞间隙增宽、细胞变圆但尚未漂浮时立即吸弃消化液并加入适量的含20% FBS的EMDM培养液终止消化，吹打分散细胞，按1∶3接种于T75曲颈培养瓶中传代培养。传代培养时EMDM培养液中FBS的浓度为10%。
1.2.2 内皮细胞的鉴定 ①每日倒置显微镜下观察内皮细胞的形态和生长特性。②血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的检测：按照EnVisionTM 两步法试剂盒提供的方法检测vWF的表达。酸化处理的盖玻片消毒后放入培养皿中，将细胞接种于盖玻片上，放入5% CO2培养箱中，37℃培养。待细胞均匀铺满盖玻片后取出细胞爬片，PBS洗涤2次，10%的多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗涤后，3 g/L h3O2封闭10 min以消除内源性过氧化物酶活性。正常非免疫血清室温孵育10 min，PBS洗涤盖玻片3次后加入抗细胞Ⅷ因子相关抗原兔多抗工作液50 μl，置于湿盒中4℃过夜，再次PBS洗涤后加50 μl辣根过氧化物酶聚合物标记的羊抗兔IgG工作液，室温下孵育30 min，PBS洗涤3次，DAB试剂盒显色5 min，苏木精复染。阴性对照用PBS代替一抗。显微镜下寻找3个具有代表性的视野，各观察100个细胞，计算阳性细胞率。
2 结 果
2.1 细胞形态学观察 植片培养60 h左右倒置显微镜下观察即可发现有内皮细胞从组织块周围移出，呈扁平多角形，边界清楚，胞质丰富，核圆形或椭圆形，居中（图1）。12天左右细胞开始融合成片，呈铺路石样（图2）。传代培养的细胞和原代形态相似，生长较快，4～5天可以融合成单层，传3～4代时，细胞开始变性、变形、脱落，不再继续生长。
2.2 vWF检测 对原代和传代细胞进行vWF染色，显示：细胞质均呈黄褐色着色，而阴性对照组无特殊显色（图3）。
在异种器官移植中，移植物血管内皮细胞表面的α-gal抗原是受体识别的主要靶抗原，而Ⅱ型内皮细胞激活又是导致延迟性排斥反应的主要因素［3-4］。因此，实现对供体血管内皮细胞的保护是目前异种移植研究领域的热点。动物血管内皮细胞资源较少，小鼠血管内皮细胞培养成功为进一步的研究工作提供了条件。在细胞培养过程中我们有以下几点体会：①选择合适的分离、培养方法。大动物血管内皮细胞的分离目前较多采用胶原酶消化和机械刮脱的方法，而小鼠的主动脉直径只有1 mm左右，组织脆弱，无论是腔内还是翻转后消化，操作都很困难，采集的细胞数量有限，也难以用刮匙刮脱内皮细胞，同时在培养过程中极易混杂其他细胞的污染。因此根据相关文献 ［5-6］，我们采用了较为适合小动物较小血管内皮细胞培养的组织植块的方法。②注意无菌操作。小鼠血管细小，需在手术显微镜下操作，因此对操作环境要求较高，我们每次采集标本前都要对手术间进行消毒，操作台铺无菌单。手术人员按手术要求洗手带无菌手套。③根据手术进程采用4～10倍手术显微镜辅助操作。我们通过血管腔内置入导引钢丝的方法更清楚地显露了目标血管，从而有效地避免了在游离血管和分离血管被膜、周围脂肪组织时对血管壁的损伤。④组织植块应尽可能的小，最好在1 mm×1 mm左右，这样更有利于细胞的移出。⑤尽早移走组织块，避免杂细胞污染。实验中我们发现：60 h左右即可在组织植块周围观察到较多的内皮细胞，继续培养则会出现杂细胞污染，而杂细胞的去除比较困难。因此应在培养60 h左右时尽快将组织植块移走，此时获取的细胞几乎无纤维细胞和平滑肌细胞等的混杂。⑥提供较好的细胞生长条件。本实验采用含20% FBS的EMDM培养液，并使用进口的一次性聚苯乙烯细胞培养瓶（皿）。先后取小鼠血管30余条/次，每条血管长约3 cm，分别进行植块培养，虽然没有添加肝素和内皮细胞生长因子，也取得了比较满意的结果。
血管内皮细胞的鉴定主要从其形态学特征、特殊的细胞标记以及生物合成代谢通路等方面入手［7-8］。实验显示：在倒置相差显微镜下观察，培养的细胞在汇合成单层后呈铺路石样，符合血管内皮细胞特殊的生长形态；免疫染色进一步证实其细胞质内存在血管内皮细胞特有的细胞标记——细胞Ⅷ因子相关抗原，阳性细胞率＞99%。结果证实：利用血管植块的方法可以获取较高纯度的小鼠血管内皮细胞。
小鼠血管内皮细胞来源匮乏，一般情况下其传代次数有限，因此建立并熟练掌握其培养方法可为将来的实验提供有力的支持。
【参考文献】
［1］ Platt JL，Fischel RJ，Matas AJ，et al. Immunopathology of hyperacute xenograft rejection in a swine-to-primate model ［J］. Transplantation，1991，52(2)：214-220.
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［3］ Gock H，Salvaris E，Murray-Segal L，et al. Hyperacute rejection of vascularized heart transplants in BALB/c Gal knockout mice ［J］. Xenotransplantation，2000，7(4)：237-246.
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［8］ Bacheti T， MOrbidelli L. Endothelial cells in culture: A model for studying vascular functions ［J］. Pharmacological Research，2000，42 (1)：9-19.