作者：苗蓓 江山 尹晓慧 刘永 关秋华 曾因明
【摘要】 目的 观察大鼠局灶性脑缺血/再灌注后丝裂原活化蛋白激酶家族中JNK1/2（c-Jun 氨基末端激酶1/2）的活化情况以及银杏叶提取物Egb761对其影响。方法 雄性成年SD大鼠随机分成3组(n=5):假手术组、生理盐水对照组和Egb761组。分别于缺血前6天每天用生理盐水4 ml和Egb761 150 mg／kg (Egb761用4 ml生理盐水溶解) 灌胃。采用线栓法致大脑中动脉栓塞(MCAO) 模型，在脑缺血再灌注后处死大鼠，对缺血侧海马进行免疫印迹法检测JNK1/2磷酸化水平。结果 局灶脑缺血/再灌注可以诱导JNK1/2激活，30 min达第1个高峰，3天达第2个高峰；Egb761可显著抑制脑缺血再灌注后JNK1/2的激活(P&<0.05)，JNK1/2的蛋白表达量在以上不同处理条件下没有明显变化。结论 局灶性脑缺血再灌注可诱导缺血侧海马JNK1/2活化， Egb761干预可使缺血侧海马JNK1/2活化受到抑制，减轻缺血侧海马的损伤。
【关键词】 Egb761 局灶脑缺血 JNK1/2 大鼠
Abstract: Objective To investigate the activation of JNK1/2 induced by focal cerebral ischemia/reperfusion in rats and the effect of Egb761 on it. Methods Male adult SD rats were randomly pided into 3 groups (n=5 each)， the sham-operation group， the vehicle control group and the Egb761 treatment group. The model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was established by thread ligation method before ischemia. The control rats were given intragastricly 4 ml of normal saline qd for 6 d and the Egb761treated rats were given intragastricly 150 mg/ kg of Egb761 dissolved in 4 ml of normal saline qd for 6 d. The rats were decapitated after reperfusion; the involved hippocampus was taken to assay the activation of JNK1/2 by Western blotting. Results The activation of JNK1/2 was induced by focal cerebral ischemia， reaching its first peak at 30 min of reperfusion and the second peak on 3 d. Egb761 evidently inhibited the JNK1/2 activation (P&<0.05). The level of JNK1/2 protein was rather steady in spite of the ways of pre-ischemic treatment in the 3 groups. Conclusion Focal cerebral ischemia/reperfusion induces JNK1/2 activation in the ischemic hippocampus; Egb761 can inhibit the activation and alleviate the ischemic injury in the ischemic hippocampus.
Key words: Egb761; focal cerebral ischemia; JNK1/2; rat
近年来人们对脑缺血/再灌注损伤进行了广泛研究，认为细胞信号级联反应参与调节中枢神经系统神经细胞的损伤［1］。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen - activated protein kinases， MAPK) 是一组细胞内广泛存在的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase， ERKs)，c-Jun 氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase， JNKs)和P38MAPK激酶，可对多种细胞外刺激起反应而调节细胞信号，被认为是从细胞表面到细胞核信号转导的重要介质［2］。JNK又称SAPK，即应激活化蛋白激酶。大量证据表明，JNK在信号通路诱导凋亡特别在死亡受体控制或短暂缺血后线粒体依赖的凋亡过程中起着关键作用［3］。有研究显示JNK1/2在全脑缺血/再灌注过程中呈现双次激活的趋势（30 min和3天）。它们的早期激活和晚期激活可能具有不同的分子机制，通常认为后者即3天的激活与迟发性神经元死亡密切相关［4］。Egb761是一种银杏叶提取物，主要有效成分为24%黄酮类和6%萜内酯类，是一种天然的自由基清除剂，具有抗氧化以及改善脑血管供血功能的作用。已有研究表明银杏叶提取物Egb761对短暂性局灶脑缺血损伤有明显保护作用［5］，但其具体作用机制尚不是十分清楚。本研究选择血管内栓线法致大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型，观察大鼠大脑缺血/再灌注后JNK1/2活化情况及Egb761干预对其影响，探讨Egb761对缺血后神经元保护作用的可能机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及给药 健康雄性SD大鼠，体重200～250 g ，由徐州医学院动物中心提供。术前夜禁食，随意进水。随机分成假手术组(sham组) 、缺血2 h再灌注组(I/R组) 、Egb761组，每组根据再灌注时间不同再分为30 min、6 h、1天、3天4个亚组，每亚组各5只鼠。Egb761 150 mg/ kg，于术前先连续灌胃给药6天，第7天给药1 h后造模。sham组、模型对照组灌服等容积的生理盐水。
1.2 主要药物和试验试剂 Egb761(德国Schwabe药厂)，兔抗JNK1/2磷酸化抗体及标准牛血清白蛋白，购自美国Sigma公司，醋酸纤维素膜(NC膜)为Amresco公司产品，NBT/ BCIP 及非磷酸化抗体均为Promega 公司产品。其他常用试剂均为国产分析纯。
1.3 模型制作 根据Nagasawa等［6］的改良线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血模型。用10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉大鼠后，将其仰卧固定，分离右侧颈总动脉(CCA)，颈内动脉(ICA) 及颈外动脉(ECA)，结扎ECA与CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA 分叉下方剪一切口，将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉，插入深度为(18.5±0.5) mm，直到有轻微阻力感为止，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留约1 cm ，缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现大脑中动脉再灌注，造模完成。在缺血2 h和再灌注1 h内，用白炽灯加热维持大鼠的体温，体温维持在肛温36.5～37.5℃。假手术组只分离CCA与ECA。动物模型建立成功后按Longa［7］法对动物的神经功能进行评分，均在2～3分，即以动物清醒后，爬行时向左转圈(追尾现象)，提尾时左前肢内收屈曲并且排除有蛛网膜下腔出血者为入组标准。术后苏醒回笼，自由食水。
1.4 样品制备和蛋白测定 大鼠缺血2 h再灌注不同时间后，断头快速取脑， 取缺血侧海马组织，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行，从液氮中取出组织加1ml匀浆缓冲液［mmol/L：MgCl2 1.5、NaCl 150、HEPES 50、EGTA1，pH 7.5;10%甘油，1% Triton X-100以及几种磷酸酶抑制剂(mmol/L：Na3VO3 1，NaF 10和β-磷酸甘油10)］。匀浆前加入蛋白抑制剂(50 mg/ L苯甲磺酰氟，5 mg/L白胃素、胃酶抑素、抑肽酶)。用匀浆器匀浆，1000 g离心20 min，小心移取上清液，按改良Lowry方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测蛋白后分装，置-80℃冰箱待用。
1.5 免疫印迹 按Hu等［8］方法，等量蛋白样品(每个泳道100 μg)经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，以湿转法电转移至NC膜上。转移缓冲液(25 mmol/ L Tris，190 mmol/L甘氨酸，20%甲醇，0.05% SDS)。转移后的NC膜经3% BSA封闭后加入稀释好的一抗(1∶2000) ，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗(羊抗兔，1∶10000) ，37℃反应2 h。洗膜，以NBT/BCIP显色，反应达到要求后，流水洗涤终止反应所得NC膜可直接用图像处理仪(Gene Company)处理。
1.6 统计学处理 数据以x±s表示，统计分析采用方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组比较采用最小显著差法（LSD），多个实验组之间比较采用q检验，检验水准：α=005。
2 结 果
2.1 局灶脑缺血再灌注后缺血侧海马组织JNK1/2的蛋白量及激活的变化 SD大鼠局灶脑缺血2 h后再灌注不同时间(30 min、6 h、1天、3天)，以抗磷酸化的JNK1/2抗体为一抗做免疫印迹，检测JNK1/2的激活;以非磷酸化的JNK1/2一抗检测JNK1/2的蛋白表达。结果显示， 在脑缺血/再灌注过程中JNK1/2呈现30 min和3天2个激活峰，分别为假手术组的2.3和2.8倍（见图1），P&<0.05，n=5。JNK1/2的蛋白量在上述不同缺血/再灌注时间点均没有明显变化。
图1 免疫印迹法测得缺血再灌注不同时间JNK1/2的蛋白表达和激活条带（n=5）
与对照组比较：*P&<0. 05；D值：与sham组比较的倍数
2.2 Egb761对脑缺血及缺血再灌注后缺血侧海马组织JNK1/2活化的影响 SD大鼠局灶脑缺血2 h后再灌注3天，以抗磷酸化的JNK1/2抗体为一抗做免疫印迹，检测JNK1/2的激活;以非磷酸化的JNK1/2一抗检测JNK1/2的蛋白表达。结果显示，Egb761可显著抑制脑缺血再灌注后3天 JNK1/2的激活(见图2，P&<0.05，n=5)，JNK1/2的蛋白表达量在以上不同处理条件下没有明显变化。
图2 免疫印迹法测得Egb761对缺血/再灌注3天时间点JNK1/2的蛋白表达和激活条带（n=5）
与对照组比较：*P&<0.05；与NaCl +再灌注3天比较：＃P&<0.05；D值：与sham组比较的倍数
3 讨 论
本实验中我们采用免疫印迹检测方法观察到局灶性脑缺血/再灌注期间大鼠缺血侧海马JNK1/2活化增多并且出现2次高峰，Egb761干预后，可以显著抑制JNK1/2活化，从而减轻脑缺血损伤。随着对脑缺血/再灌注损伤机制研宄的不断深入，越来越多的证据表明细胞信号转导系统对缺血后中枢神经系统神经细胞的存活与死亡起着重要的调节作用［1］。MAPKs是一组分布于胞质中具有丝氨酸/ 苏氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，激活的MAPKs通过磷酸化多种转录因子、细胞骨架相关蛋白和其他酶类等多种蛋白底物来调节多种细胞生理过程，从而对刺激细胞的信号作出必要的反应，参与了细胞生长、发育、分裂、死亡及细胞间的功能同步化等多种生理过程，是细胞外信号引起的细胞核反应的共同通路［2］。通过对脑缺血后MAPKs途径的研究，了解在脑缺血后其动态、复杂和时间依赖性的变化环节和规律，以寻找可行的方法来调控、阻断信号转导途径来减少神经细胞的死亡，从而为脑缺血/再灌注损伤的基础研究和临床救治提供新的视角和手段。
综上所述，脑缺血/再灌注可以激活JNK信号通路，Egb761可以抑制JNK信号通路的激活，表明Egb761对大鼠脑缺血/再灌注损伤有良好的保护作用，对JNK信号通路进行调节，抑制JNK死亡通路，进而抑制细胞凋亡是Egb761脑保护的可能机制之一。
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