关于survivin——一种癌症治疗的新分子标靶

　　　　　　 作者：高立永，卢敏华，孔庆兖

【摘要】 survivin 是凋亡抑制蛋白家族的成员，表达于大多数肿瘤组织中，而在正常组织中未见有表达。survivin主要表达于细胞周期的G2/M期。它具有抑制凋亡、调控有丝分裂等功能。随着分子生物学的发展，survvin基因成为肿瘤治疗的分子标靶，使得survivin表达下降，继而促进细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。
【关键词】 survivin；癌症；基因治疗；分子标靶

　　随着医学的发展，治疗癌症的化疗药物数量及种类急剧上升，但癌症患者的整体存活率却没有明显上升。这种情况，引起了医学家的思索。化疗药物一方面起到治疗作用，同时另一方面，化疗药物的毒副作用对患者的身体起到破坏作用。因此，寻找疗效高副作用小的方法是抗癌治疗的方向。随着分子生物学的发展，针对肿瘤基因进行靶向治疗成为癌症治疗研究的方向。药物作用于肿瘤某分子、某基因等靶向部位，一方面提高了疗效，另一方面减少了药物的用量。寻找能成为肿瘤治疗的标靶已成为治疗肿瘤的前提之一。可能成为药物作用的标靶包括：癌细胞具有的特殊的抗原、特殊生长因子受体、肿瘤血管生长相关因子、癌细胞特殊信息传递途径中的各种分子、癌细胞内细胞周期和细胞凋亡的调控分子等。凋亡抑制因子家族中有一个新成员survivin，在凋亡和细胞周期的基因调控中发挥着重要的作用，越来越成为有吸引力的治疗靶点之一。
　　1 survivin 的分子生物学特性
　　survivin 是由Altieri 等在1997年发现的，是IAP（inhibitor of apoptosis of protein）家族的成员， 由142 个氨基酸组成的相对分子质量为16. 5×103的蛋白［1］。它是一种凋亡抑制因子，主要表达于细胞周期的G2/M期。survivin 基因位于染色体17q25靠近端粒的位置，由3个内含子和4个外显子组成。IAP家族蛋白包含2个或3个串联的含有半胱氨酸/ 组氨酸的杆状病毒IAP 重复序列(baculoviral IAP repeat，BIR），与此相邻的羧基末端含有一个环指结构，只有含有BIR2 功能区的IAP 蛋白分子才具有结合和抑制死亡蛋白酶(caspase蛋白酶)的功能，单一的BIR1、BIR3 或环指结构以及他们的任意组合蛋白体均无此效应［2］。而survivin仅含单个BIR 单元，其C末端是兼性的α螺旋，没有环指结构［3］。survivin通常以二聚体形式存在。这些特殊结构可能是其凋亡抑制功能的结构基础。
　　2 survivin 的分布
　　2．1 在组织中的表达与分布 survivin广泛表达于各种胚胎组织中［4］，并受生长发育调节。随着胚胎的发育成熟，survivin 的分布逐渐局限，表达水平逐渐降低，在终末分化组织中不表达。它过多表达于绝大多数常见的恶性肿瘤如肺癌［5］、乳腺癌［6］、结肠癌［7］、胃癌［8］、食管癌［9］、胰腺癌［10］、肝癌［11］、子宫内膜癌［12］、卵巢癌［13］、霍奇金病［14］，以及大约50%的非霍奇金淋巴瘤［1］等，而在这些肿瘤中相对应的正常组织不表达survivin 。Miyachi等［15］对survivin在胃癌中的表达情况进行了研究，发现107例胃癌标本中有105例survivin mRNA 表达阳性，survivin mRNA的表达与胃癌的组织学分型以及胃癌浸润的深度无关，但与胃癌的淋巴结转移密切相关。他们认为survivin mRNA表达的增加出现在胃癌发生的早期，并且survivin mRNA 表达水平的高低可以作为判定胃癌患者淋巴结转移潜能高低的指标。
　　2．2 survivin 在细胞中的分布 Fortugno等［16］对survivin亚细胞定位进行了深入的探讨，认为在细胞内有2个survivin蛋白池，一个是胞质池，一个是核池，蛋白池的核浆比为1∶6。80%的胞质池与有丝分裂期的中心体、微管、中期和后期的有丝分裂纺锤体微管、纺锤体两极紧密相关，而20%的survivin的胞核池与中期染色体着丝粒和后期中央纺锤体中间带紧密联系。
　　3 survivin的功能与作用机制
　　survivin 在细胞凋亡和增生中发挥重要作用，在肿瘤新生血管的形成中也有一定的作用。
　　3．1 抗凋亡作用 实验显示［17］，survivin通过内源性和外源性2条凋亡信号通路直接或间接抑制caspase-3、7而实现其抗凋亡功能。其具体作用机制目前尚不清楚。目前比较趋于一致的认识是，survivin可能是通过线粒体途径实现抗凋亡功能。在转基因动物实验上显示，survivin定位于线粒体上，并且与上游的caspase-9和第2凋亡刺激因子（SMACE/DIABLO）相互作用，最后影响终端效应子caspase-3、7的活性，使细胞发生凋亡［18］。
　　3．2 调控有丝分裂，参与细胞增殖 有研究提示［19］，survivin在细胞分裂晚期参与染色体的分离和胞质分裂的完成。 survivin 敲除鼠的动物实验也证实了survivin在有丝分裂中起着重要作用，并证明survivin同样在胚胎发育时期是至关重要的。在起初胚胎发育的2.5天，纯合子survivin基因的删除导致微管集合失败、有丝分裂纺锤体后缺失、紊乱的微管排列和多核细胞形成，最后导致胚胎死亡［20］。
　　3．3 调节肿瘤血管生成 正常血管内皮细胞不表达survivin，而体内外研究证明肿瘤血管内皮细胞过度表达survivin，使得肿瘤血管内皮细胞凋亡减少，有利于肿瘤生长［21］。总之，肿瘤组织过表达survivin可以避开凋亡检查点，使细胞进行异常有丝分裂，同时survivin的过表达对抗多种广泛的凋亡诱导［22］。
　　4 survivin 是一个抗癌标靶
　　一种理想的分子标靶应有以下特点［23］：①大多数癌细胞有此标靶且大量表现；②与癌症的致病机制有关；③与癌细胞的生存功能有关；④其功能对正常细胞是不必要的或较少有表现；⑤此分子标靶在肿瘤中少有变异性或突变率低；⑥不易由细胞表面脱落或分泌。而survivin 具有上述特点，因此可以作为肿瘤治疗的标靶。
　　5 靶向治疗
　　药物现在，survivin已经成为倍受关注的抗肿瘤治疗的新靶点［24］，以survivin为靶点的拮抗分子纷纷研究出来，如：应用反义survivin降低细胞凋亡的阈值，促使肿瘤细胞凋亡增加；RNA干涉survivin基因的表达；设计survivin突变体以及特异性抗体的免疫治疗［25］。这些策略具有良好的靶向性、特异性及安全性。
　　5．1 反义survivin 反义技术是根据核酸互补杂交原理特异性抑制特定基因mRNA表达的一种生物高技术。利用反义技术合成的药物称为反义药物。反义药物一般是指以特定基因（mRNA）为靶，并与之特异性互补结合的一段约由20个核苷酸组成的人工合成寡核苷酸。反义核酸可以与RNA 形成DNA-RNA异源双链，也可形成RNA-RNA双链。 将反义核苷酸转染到细胞内，阻断内源性survivin mRNA的表达，已取得了可喜的结果。在许多肿瘤细胞系中进行了实验，如肝癌细胞系［26］、肺癌细胞系［27］、胃癌细胞系［28］、胰腺癌细胞系［29］、卵巢癌细胞系［30］、乳腺癌细胞系［31］等，反义survivin寡核苷酸可以诱导这些细胞的凋亡。自Zamecnik等［32］首次报道以反义寡核苷酸抑制劳氏肉瘤病毒复制后，反义寡核苷酸便迅速应用于肿瘤的研究。无论是生物合成的还是体外合成的反义寡核苷酸，只有进入靶细胞，才可与靶向基因结合，发挥调节作用。反义寡核苷酸是如何进入细胞内、转染效率的高低、剂量多少等，是其开发应用中的瓶颈。分子生物学技术的发展及各种运送载体的出现和改进，如利用脂质体等介导反义分子、电转染、噬菌体运用、改造反转录病毒等方法已使转染效率明显提高［33］。我们相信，随着分子生物学技术的发展，这一问题最终能得到解决。目前，还不清楚反义核苷酸是如何抑制肿瘤生长的。较一致的看法是，对survivin的干扰有可能导致肿瘤细胞有选择性的凋亡［18］。然而不能排除另外一种可能，即靶向survivin 的基因治疗可能损害内皮细胞的活性，从而干扰肿瘤血管生成。这是因为研究发现在肿瘤血管增殖或塑型期，内皮细胞内survivin表达增加［34］。
　　5．2 免疫技术 目前有几个研究小组已经开展了这方面的研究，他们在体外和体内均观察到T 细胞能够产生一种活性很强的、针对survivin 多肽的细胞毒性作用［35-36］。而且这种细胞毒性作用具有特异性，对正常组织无影响。研究显示，针对于survivin的肿瘤特异性免疫反应，可用于肿瘤疫苗的研究。
　　5．3 RNA干扰survivin表达技术 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引起与其同源的mRNA特异性的降解，从而抑制survivin基因的转录和表达，具有高度特异性、高效性的特点。有研究者［37~39］利用RNA干扰技术设计针对survivin的dsRNA来抑制survivin基因的转录和表达，实验取得一定的成功。
　　5．4 survivin显性负突变(dominant-negative mutant)体诱导细胞凋亡 survivin的多肽序列中，34位氨基酸为苏氨酸，是细胞周期素依赖蛋白激酶P34-cdc2的磷酸化位点，该位点的磷酸化对维持survivin的凋亡抑制功能非常重要，以丙氨酸取代后的人工突变体(T34A)可以使凋亡抑制功能丧失，Mesri等［40］发现PAd-T34A(复制缺陷的腺病毒携带编码survivin突变体)感染乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、大肠癌等细胞株，导致细胞色素C从线粒体释放，促进caspase-3活化引起肿瘤细胞凋亡，而PAd-T34A不影响成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等处于增殖状态的正常人类细胞的生存能力。该研究同时显示PAd-T34A可以促进肿瘤血管内皮细胞的凋亡。除了T34A survivin突变体可以诱导细胞凋亡外，另外还有C84A(Cys84/Ala)突变体［19］，它与野生型survivin蛋白竞争中心粒，抑制野生型survivin蛋白与中心粒的结合，从而剥夺野生型survivin蛋白的抗凋亡促增殖的双重功能，最终导致细胞凋亡和细胞分裂缺陷，出现多核细胞和多极点细胞。总之，以survivin为靶点很可能是一种理想的肿瘤治疗策略，不但可以提高抗肿瘤疗效，而且能弥补其他治疗措施的不足，在临床肿瘤治疗中可能有广阔的应用前景。当然，如果要将其成功地应用于临床，尚需要更多的体内体外实验来不断地完善和改进所遇到的问题。

［2］ Tamm I， Wang Y， Sausville E， et al. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95)， Bax， caspases， and anticancer drugs［J］. Cancer Res，1998，58（23）:5315-5320.

［3］ Shin S， Sung BJ， Cho YS， et al. An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and-7［J］. Biochemistry，2001，40（4）:1117-1123.

［4］ Adida C， Crotty PL， McGrath J， et al. Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse differentiation［J］. Am J Pathol，1998，152(1):43-49.

［5］ Monzó M， Rosell R， Felip E， et al. A novel anti-apoptosis gene: re-expression of survivin messenger RNA as a prognosis marker in non-small-cell lung cancers［J］. J Clin Oncol，1999，17(7):2100-2104.

［6］ Tanaka K， Iwamoto S， Gon G， et al. Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas［J］. Clin Cancer Res，2000，6(1):127-134.

［7］ Kawasaki H， Altieri DC， Lu CD， et al. Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer［J］. Cancer Res，1998，58(22):5071-5074.

［8］ Lu CD， Altieri DC， Tanigawa N. Expression of a novel anti-apoptosis gene， survivin， correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas［J］. Cancer Res，1998，58(9):1808-1812.

［9］ Kato J， Kuwabara Y， Mitani M， et al. Expression of survivin in esophageal cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy［J］. Int J Cancer，2001，95(2):92-95.

［10］ Satoh K， Kaneko K， Hirota M， et al. Expression of survivin is correlated with cancer cell apoptosis and is involved in the development of human pancreatic duct cell tumors［J］. Cancer，2001，92(2):271-278.

［11］ Ikeguchi M， Ueta T， Yamane Y， et al. Inducible nitric oxide synthase and survivin messenger RNA expression in hepatocellular carcinoma［J］. Clin Cancer Res，2002，8(10):3131-3136.

［12］ Saitoh Y， Yaginuma Y， Ishikawa M. Analysis of Bcl-2， Bax and Survivin genes in uterine cancer［J］. Int J Oncol，1999，15(1):137-141.

［13］ Yoshida H， Ishiko O， Sumi T， et al. Survivin， bcl-2 and matrix metalloproteinase-2 enhance progression of clear cell- and serous-type ovarian carcinomas［J］. Int J Oncol，2001，19(3):537-542.

［14］ Garcia JF， Camacho FI， Morente M， et al. Hodgkin and Reed-Sternberg cells harbor alterations in the major tumor suppressor pathways and cell-cycle checkpoints: analyses using tissue microarrays ［J］. Blood，2003，101(2):681-689.

［15］ Miyachi K， Sasaki K， Onodera S， et al. Correlation between survivin mRNA expression and lymph node metastasis in gastric cancer［J］. Gastric Cancer，2003，6(4):217-224.

［16］ Fortugno P， Wall NR， Giodini A， et al. Survivin exists in immunochemically distinct subcellular pools and is involved in spindle microtubule function［J］. J Cell Sci，2002，115(3):575-585.

［17］ Jiang X， Wilford C， Duensing S， et al. Participation of Survivin in mitotic and apoptotic activities of normal and tumor-derived cells［J］. J Cell Biochem，2001，83(2):342-354.

［18］ O’Connor DS， Grossman D， Plescia J， et al. Regulation of apoptosis at cell pision by p34cdc2 phosphorylation of survivin ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(24):13103-13107.

［19］ Skoufias DA， Mollinari C， Lacroix FB， et al. Human survivin is a kinetochore-associated passenger protein［J］. J Cell Biol ，2000，151(7):1575-1582.

［20］ Uren AG， Wong L， Pakusch M， et al. Survivin and the inner centromere protein INCENP show similar cell-cycle localization and gene knockout phenotype［J］. Curr Biol，2000，10(21):1319-1328.

［21］ Papapetropoulos A， Fulton D， Mahboubi K， et al. Angiopoietin-1 inhibits endothelial cell apoptosis via the Akt/survivin pathway ［J］. J Biol Chem，2000，275(13):9102-9105.

［22］ 惠文涛，南克俊.凋亡抑制蛋白survivin的研究进展［J］.第四军医大学学报，2005，26(19):1811-1812.

［23］ Hsieh RK. Molecular targeted therapy for solid tumors［J］. Formosan J Med，2003，7（3）:222-226.

［24］ Nam NH， Parang K. Current targets for anticancer drug discovery［J］. Curr Drug Targets，2003，4(2):159-179.

［25］ Andersen MH， thor SP. Survivin:a universal tumor antigen［J］. Histol Histopathol，2002，17(2):669-675.

［26］ 陈 涛，田伏洲，蔡忠红，等. Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的作用［J］.中华肝脏病杂志，2003，13（9）：546-549.

［27］ 巴 一，Reisfeld Ralph A. Survivin反义寡核苷酸对小鼠肺癌的生长抑制作用［J］.同济大学学报（医学版），2005，26(2):1-4.

［28］ 王晓梅，王一平，董 芸.生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901生长的影响［J］.实用癌症杂志，2005，20(1):24-27.

［29］ 戴德坚，陆才德，赖日勇，等.靶向抑制survivin对胰腺癌细胞增殖和凋亡效应的影响［J］.中华医学杂志，2004，84（22）：1894-1898.

［30］ 阮 菲，解先宽，刘少阳.Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌耐药细胞COC1/DDP抑制的实验研究［J］.癌症，2004，23（8）：896-899.

［31］ 刘德权，段体德，杨策尧.Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响［J］.昆明医学院学报，2005，26(3):45-50.

［32］ Zamecnik PC， Stephenson ML. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide［J］. Proc Nati Acad Sci，1978，75(1):280-284.

［33］ Fillion P， Desjardins A， Sayasith K， et al. Encapsulation of DNA in negatively charged liposomes and inhitition of bacterial gene expression with fluid liposome-encapsulated antisense oligonucleotides［J］. Biochim Biophys Acta，2001，1551(1):44-54.

［34］ O’Connor DS， Schechner JS， Adida C， et al. Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial cells［J］. Am J Pathol，2000，156(2):393-398.

［35］ Reker S， Becker JC， Svane IM， et al. HLA-B35-restricted immune responses against survivin in cancer patients［J］. Int J Cancer，2004，108(6):937-941.

［36］ Pisarev V， Yu B， Salup R， et al. Full-length dominant-negative survivin for cancer immunotherapy［J］. Clin Cancer Res，2003，9(17):6523-6533.

［37］ 李莉萍，梁念慈，罗超权存活素siRNA表达质粒的构建及其对MCF-7细胞细胞周期和增殖的调控［J］癌症，2004，23（7）：742-748

［38］ Ling X， Li F. Silencing of antiapoptotic survivin gene by multiple approaches of RNA interference technology［J］. Biotechniques，2004，36(3):450-454，456-460.

［39］ Coumoul X， Li W， Wang RH， et al. Inducible suppression of Fgfr2 and Survivin in ES cells using a combination of the RNA interference (RNAi) and the Cre-LoxP system［J］. Nucleic Acids Res， 2004，32(10):e85.

［40］ Mesri M， Wall NR， Li J， et al. Cancer gene therapy using a survivin mutant adenovirus［J］. J Clin Invest， 2001，108(7):981-990.