作者：申文 马正良 黄小冬 曾因明
【摘要】 目的 观察脊髓水平氟代柠檬酸(fluorocitrate)对骨癌痛小鼠机械痛敏和热痛敏的影响，探讨脊髓星形胶质细胞在伤害性信息传递中的作用。方法 C3H/HeJ 小鼠48只，随机分为6组(n = 8) :假手术组( Sham组)，骨癌组，骨癌+生理盐水组，骨癌+氟代柠檬酸0.25 nmol/5 μl、0.50 nmol/5 μl、0.75 nmol/5 μl组。骨癌组和Sham组测定术前及术后7、12、17、21天小鼠机械缩腿阈值(MWT)和热缩腿潜伏期(TWL)；骨癌各剂量组在第17天 鞘内给予不同剂量的氟代柠檬酸，测定给药前和给药后15 min、30 min、1 h、2 h MWT和TWL值。结果 骨癌组从术后12天开始直到本实验观察的术后21天，MWT和TWL均明显降低，与Sham组相比具有显著性差异( P＜0.01)；骨癌+生理盐水组小鼠在各个时间点上与给药前相比MWT和TWL无明显改变( P＞0. 05)；骨癌+氟代柠檬酸各个剂量组小鼠在给药后MWT和TWL均逐渐增加，具有剂量依赖性，并随时间的延长又逐渐恢复到给药前水平；骨癌+氟代柠檬酸0.75 nmol/5 μl组在给药后30 min时作用最明显，与给药前和盐水组相比 P＜0.01。结论 鞘内注射氟代柠檬酸能明显减轻骨癌痛小鼠机械痛敏和热痛敏，提示星形胶质细胞在脊髓水平参与疼痛信息传递。
【关键词】 骨癌痛；脊髓；星形胶质细胞；氟代柠檬酸
癌症痛严重影响患者的生活质量，而新的癌症痛动物模型的出现，为研究癌症痛的机制，寻找新的治疗方法提供了良好契机。大量研究表明星形胶质细胞参与了痛信号的转导，氟代柠檬酸（fluorocitrate）为星形胶质细胞代谢抑制剂，其鞘内注射在骨癌痛中是否可以产生抗伤害作用，目前鲜见文献报道。本实验拟观察鞘内注射氟代柠檬酸对骨癌痛小鼠机械和热痛阈值的影响，探讨脊髓星形胶质细胞在骨癌痛伤害性信息传递中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物及仪器试剂 实验采用C3H/HeJ小鼠，5~6周，体重20~25 g，由中国科学院上海实验动物中心提供，NCTC2472骨纤维肉瘤细胞株购自American Type Culture Collection (ATCC)。氟代柠檬酸(fluorocitrate)为美国Sigma公司产品， 批号：Sigma F-9634，配制方法：秤取4 mg氟代柠檬酸钡盐溶于0.5 ml盐酸(1 mol)，加1或1.5滴Na2SO4(0.1 mol)，再加1 ml磷酸缓冲液(0.1 mol)，以12 000 g离心5 min，取上清加生理盐水至4.8 ml此即为1 nmol/μl。Von Frey细丝购自美国Stoelting公司；热痛刺激仪BME2410A，中国医学科学院生物工程研究所生产。
1.2 细胞培养 细胞培养基采用NCTC135培养基，其中含有10%的马血清，ATCC所推荐，每周传代1次，按1∶4~6扩增。
1.3 骨癌痛模型的建立 参照Schwei等［1~3］所报道方法建立模型，小鼠麻醉后(戊巴比妥50 mg/kg，i.p)，行右膝关节切开术，暴露股骨关节面，然后用4号注射针头钻穿股骨，再换用20 μl微量注射器将含有2×105个肿瘤细胞的α-MEM培养基(内含1%牛血清白蛋白) 20 μl注入股骨远端，假手术组只注入20 μl α-MEM培养基(内含1%牛血清白蛋白)。注射完毕用牙科玻璃离子封住针孔，再用无菌生理盐水冲洗创面，创口缝合。
1.4 小鼠鞘内注射(intrathecal injection，ith) 按压小鼠腰骶两侧固定，自L5–6棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。注射用10 μl 微量进样器进行，注射容积为5 μl，注射时间10 s，留针20 s。
1.5 动物分组及给药 C3H/HeJ 小鼠48只，随机分为6组(n= 8):假手术组( Sham)；骨癌+生理盐水组：模型成功建立后17天鞘内注射生理盐水5 μl；骨癌 +氟代柠檬酸0.25 nmol/5 μl、0.5 nmol/5 μl、0.75 nmol/5 μl组：模型成功建立后第17天分别鞘内注射氟代柠檬酸0.25 nmol/5 μl、0.5 nmol/5 μl、 0.75 nmol/5 μl。 所有药物均用生理盐水稀释到5 μl。
1.6 行为学测定 MWT测定：Von Frey 纤维细丝测定小鼠的机械性缩足阈值(mechanical withdrwal threashold， MWT)［4］，将一有机玻璃箱（5 cm×5 cm×10 cm）置于金属筛网上，小鼠放置于玻璃箱中，待小鼠在有机玻璃箱中适应30 min后，用Von Frey纤维丝垂直刺激小鼠后肢足底中部，持续时间≤4 s，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定首先从1.0 g开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激；如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第1次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次。每次刺激间隔30 s，以此向下推算小鼠50%缩足阈值。
热缩腿潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）的测定，将有机玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法［5］用热痛刺激仪照射小鼠足底，照射开始至小鼠出现抬腿回避时为TWL。自动切断时间为25 s，以防止组织损伤。热刺激强度在整个实验过程中维持一致。每只动物测定5次，每次间隔3 min，取后3次平均值为小鼠TWL值。
1.7 组织学观察 模型建立后第21天行小鼠心脏灌注取材后，再取下右侧股骨进行修剪，去除周围少量肌肉组织，再在4%多聚甲醛液固定1周，然后转移到10%的EDTA中进行脱钙3周，石蜡切片，苏木精-伊红染色，镜下观察肿瘤细胞生长和骨结构的破坏情况。
1.8 统计学处理 所有数据均采用±s表示，用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，组内比较采用配对t检验，组间比较采用方差分析，P＜ 0.05认为有统计学意义。
2 结 果
2.1 癌痛小鼠痛敏变化 小鼠机械痛敏的测量通过对小鼠后爪中部Von Frey纤维细丝的刺激所产生的缩足反应以及热刺激小鼠抬足次数，与Sham组对比，骨癌组术后第7天MWT及TWL统计无明显差异(P＞0.05)，而第12、17天表现为MWT及TWL值下降(P＜0.05)，第21天行为学表现更为明显(P＜0.01)。各组MWT及TWL分别在2.60 g和14.50 s左右，术后假手术组各时间点均无统计学差异(P＞0.05)，而骨癌组表现为MWT及TWL均下降(P＜0.05)，至21天最明显(P＜001)。见表1。表1 鞘内注射氟代柠檬酸对骨癌痛小鼠行为学的影响
2.2 骨癌痛小鼠组织学观察 模型建立后第21天，小鼠右股骨病理切片显示，骨髓腔完全被肿瘤细胞所填充，中央大部分肿瘤细胞已退变坏死，而在骨髓腔的边缘部分，肿瘤细胞多呈活跃状态，肿瘤向外生长骨皮质完全破坏，范围广泛。假手术组各时间点小鼠右股骨病理切片显示，骨髓腔内见各种正常的骨髓细胞，未见其他骨结构的改变(见图1)。
2.3 癌痛小鼠鞘内注射氟代柠檬酸对其MWT和MWT的影响 骨癌+生理盐水组小鼠在各时间点与给药前相比MWT和TWL无明显改变(P＞0.05)；图1 模型建立后第21天小鼠右侧股骨病理切片而氟代柠檬酸各剂量组小鼠在给药后MWT和TWL均逐渐增加，并随时间的延长又逐渐恢复到给药前水平。氟代柠檬酸0.25 nmol/μl组在给药后15 min和30 min后能明显增加小鼠的MWL和TWL，与给药前和盐水组相比有统计学意义(P＜0.05)；随着剂量的增加，小鼠的MWT和TWL均明显增加且持续时间也明显延长，氟代柠檬酸0.75 nmol/μl组在给药后30 min时达到最大效应(P＜ 0.01)，并且持续到给药后2 h。给药后2 h各组均恢复到给药前水平(见表2、3) 。各鞘内给药组对大鼠运动功能均无影响。表2 鞘内注射氟代柠檬酸对骨癌痛小鼠机械痛敏阈值的影响 表3 鞘内注射氟代柠檬酸对骨癌痛小鼠热痛敏阈值的影响
1999年，Schwei等 ［1］首次在小鼠的一侧股骨髓腔内注射同品系的溶骨纤维肉瘤细胞，种植后的第21天，通过X线片可以观察到明显的骨质破坏，组织学切片显示破坏的程度与疼痛行为学表现呈正相关。在国外研究的基础上，我们将溶骨纤维肉瘤细胞注入小鼠股骨髓腔内，在小鼠术后12天开始出现机械痛敏和热痛敏，并且随着时间的推移，机械痛敏和热痛敏表现越明显，从行为学和组织学两方面证明成功复制此模型。在实验中，我们发现最易导致建立模型失败的是出血问题，骨髓腔穿刺时很容易导致髓腔出血，出血不止则无法进行癌细胞注射。通过反复的摸索，在止血方面我们采用2种方法以减少出血：其一是用一细长橡皮条作为止血带结扎股骨的上端，时间保持在2 min之内；其二，穿刺点用眼科玻璃离子封闭，此措施更易于封住针眼而不致肿瘤细胞从针孔外溢，导致肿瘤在骨外生长，造成模型失败，同时也要注意无菌操作。 以往实验证明在慢性给予吗啡引起的耐受中星形胶质细胞的代谢产物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）显著升高，而给予氟代柠檬酸则可以减少吗啡的耐受作用，增强其镇痛作用［6］，即抗胶质细胞与吗啡镇痛有协同作用，间接证明了胶质细胞可能参与疼痛的维持和发展。此外在神经损伤以及炎性痛模型的动物实验中，鞘内注射 1 nmol的氟代柠檬酸能够明显的减轻由于神经损伤和炎症引起的痛觉过敏和异常性疼痛［7-8］，提示星形胶质细胞与疼痛信息的传递关系密切。 在本实验中我们建立稳定的骨癌痛模型后，经鞘内注射星形胶质细胞代谢抑制剂氟代柠檬酸，从行为学的角度观察到其对骨癌痛小鼠具有镇痛作用。在实验中采用鞘内注射的方式，可使药物直接作用于脊髓的不同靶位，避免或最大限度地排除经静脉或腹腔给药对机体中枢神经系统以外的影响，使观察结果更为可靠；3个剂量组的结果均显示不影响小鼠的运动功能。对于大鼠1 nmol剂量的氟代柠檬酸能够完全、可逆的阻断星形胶质细胞的新陈代谢，而并不影响神经元的代谢作用［9］。我们在预实验中观察到，1 nmol以上氟代柠檬酸鞘内注入可使小鼠的活动明显增多，而本实验所用药物剂量对小鼠运动功能无影响。实验中观察到3个剂量组均能够明显减轻骨癌痛小鼠形成的机械痛敏和热痛敏，且随着剂量的增加而增强，持续时间也延长，提示星形胶质细胞参与了骨癌痛小鼠伤害性信息的传递。其可能机制为：星形胶质细胞是兴奋性神经递质代谢的重要场所，骨癌痛中星形胶质细胞激活后导致神经末梢谷氨酸堆积以至引起神经系统的过度兴奋；此外激活的星形胶质细胞可以分泌一系列的细胞因子和生长因子，改变神经元周围的神经化学环境，导致中枢敏感化，而氟代柠檬酸能够能够通过抑制顺乌头酸酶而选择性的抑制星形胶质细胞的代谢活性，进而抑制中枢敏化的形成而产生抗伤害作用。具体机制，有待于进一步实验研究证明。
【
参考文献
】［1］ Schwei MJ， Honore P， Rogers SD， et al. Neurochemical and cellular reorganization of the spinal cord in a murine model of bone cancer pain［J］. J Neurosci， 1999，19 (24):10886-10897.
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［3］ Luger NM， Mach DB， Sevcik MA， et al. Bone cancer pain: from model to mechanism to therapy［J］. J Pain Symptom Manage， 2005，29(5 Suppl):S32-46
［4］ Chaplan SR， Bach FW， Pogrel JW， et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw［J］. J Neurosci Methods， 1994， 53(1): 55-63
［5］ Hargreaves K，Dubner R，Brown F， et al. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia［J］. Pain， 1988， 32(1): 77-88
［6］ Watkins LR，Milligan ED，Maier SF. Spinal cord glia: new players in pain［J］ .Pain，2001，93 (3):201-205
［7］ Watkins LR， Martin D， Ulrich P，et al. Evidence for the involvement of spinal cord glia in subcutaneous formalin induced hyperalgesia in the rat ［J］. Pain，1997，71(3):225–235
［8］ Clark AK， Gentry C， Bradbury EJ，et al. Role of spinal microglia in rat models of peripheral nerve injury and inflammation［J］. Eur J Pain， 2007，11(2):223-230
［9］ Hassel B， Paulsen RE， Johnsen A， et al. Selective inhibition of glial cell metabolism in vivo by fluorocitrate［Ｊ］. Brain Res，1992，576(1): 120-124
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