【关键词】 苦参素;肾小球系膜细胞;TGF-β1;α-SMA
苦参素是从中药广豆根中分离所得的生物碱类，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗肿瘤等生物学作用［2］。近来有研究报道，用它治疗慢性肝炎可有效地降低谷丙转氨酶（ALT），改善临床症状，并使乙型肝炎及丙型肝炎病毒标志物转阴，并具有防治肝纤维化的作用［3~5］。本实验旨在探讨苦参素对肾小球系膜细胞的作用，为临床防治肾脏纤维化提供新的思路。
1 资料和方法
1.1 材料与仪器 肾小球系膜细胞株由东南大学附属中大医院刘必成教授惠赠，试剂为苦参素注射液(100 ml，600 mg，批号001244，上海第一生化药业公司) ，DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑（MTT）、二甲基亚砜、SP-9000HistostainTM-Plus Kits免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）、兔抗人TGF-β1多克隆抗体、鼠抗人α-SMA多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），仪器为LECIA Qwin图像处理与分析系统、酶标仪(Thermo Electron Corporation)。
1.2 方法
1.2.1 MTT法检测不同浓度的苦参素对肾小球系膜细胞增殖的影响 用0.25%胰蛋白酶消化单层培养的肾小球系膜细胞，再用含10%胎牛血清的DMEM 培养液稀释为单个细胞悬液，以4×104细胞密度接种于96孔培养板。24 h后细胞完全贴壁展开，用含10%小牛血清的DMEM 培养液同步化细胞，每孔100 μl，同时每孔加入经上述培养液倍比稀释的苦参素100 μl，至苦参素终末浓度分别为0.28、0.56、1.12、2.24、4.48、62.5、125、250、500、1 000 mg/L。每种浓度设6个复孔，并设6个对照孔（不加苦参素而加入等量的培养液），另设6个空白对照孔（不加细胞，其他条件与前相同）。将培养板移入CO2孵箱中，培养24 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L，PBS) 10 μl，37℃避光继续孵育4 h，终止培养。吸去孔内上清液，每孔加入100 μl DMSO溶解液振荡10 min，待结晶物充分溶解后(溶液呈蓝紫色) ，酶标仪上检测各孔光吸收值(D492) ，将所得结果列入表1。
1.2.2 细胞免疫组化法检测肾小球系膜细胞TGF-β1，α-SMA表达水平 将24孔板内培养的细胞爬片用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛（0.01 mol/L的PBS配制）固定细胞15 min，PBS洗3次后，3%的h3O2去离子水孵育10 min。滴加封闭液室温孵育15 min，不洗。滴加0.01 mol/L的PBS稀释的兔抗人TGF-β1多克隆抗体（1∶100）和鼠抗人α-SMA多克隆抗体（1∶100），4℃过夜，PBS洗3次，每次3 min，滴加生物素化二抗，37℃孵育15 min，PBS洗3次，每次3 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育15 min，PBS洗3次，每次3 min。DAB显色10 min，自来水充分冲洗。采用LECIA Qwin图像处理与分析系统进行灰度分析，阳性染色细胞为胞质内具有黄色或棕黄色的颗粒，阴性对照不加一抗。结果见表2、3和图1。
1.3 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件处理，数据以±s表示，各组间均数比较采用单因素方差分析检验。P&<0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 苦参素对肾小球系膜细胞增殖的影响 不同浓度的苦参素和细胞共同培养24 h后发现1.12 mg/L浓度的苦参素促进细胞增殖的作用较强，和对照组比较P&<0.05。在这一浓度以下，随浓度的增高，促增殖作用有增强趋势，当超过这一浓度后，促增殖作用有逐渐下降趋势。结果见表1。
2.2 苦参素对肾小球系膜细胞α-SMA、TGF-β1合成的影响 不同浓度的苦参素和细胞共同培养24 h后，α-SMA免疫组化染色发现苦参素对肾小球系膜细胞α-SMA合成无明显影响（P&>0. 05）；TGF-β1免疫组化染色发现苦参素对肾小球系膜细胞TGF-β1合成具有抑制作用，其中125 mg/L浓度组作用较强（P&<0. 05）。结果见表2、图1。表1 不同浓度的苦参素作用于肾脏系膜细胞24 h后，平均每孔的吸光度表2 各浓度苦参素作用后测得肾脏系膜细胞α-SMA细胞免疫组化染色灰度免疫组化染色结果（×400）A：人肾小球系膜细胞TGF-β1免疫组化染色，经500 mg/L的苦参素作用24 h，可见胞质内有棕黄色颗粒，胞核淡染。B：人肾小球系膜细胞免疫组化染色，正常对照组。 3 讨 论
目前认为，肾脏纤维化发生的主要机制是肾小球细胞外基质(ECM ) 的过度增多和异常沉积。在肾脏固有细胞中，肾小球系膜细胞在肾脏纤维化的发生发展中发挥重要作用，在各种致病因子的作用下，系膜细胞发生表型转化，由静止表型转化为分泌表型，分泌多种细胞因子，参与肾脏纤维化。TGF-β1是系膜细胞分泌的细胞因子之一，也是迄今已知作用最强的一种促进肾脏纤维化的细胞因子，具有调节细胞的增殖、分泌、迁移和凋亡等多种生物学活性。其在肾纤维化中的作用涉及到ECM、细胞增殖及转分化、炎症浸润等各个环节，它既能促进ECM 的生成，又能通过直接或间接途径抑制ECM 的降解，能诱导小管上皮细胞凋亡或转分化为成纤维细胞而破坏小管细胞的完整性，使其正常表型丧失，能分泌一系列炎性因子和分子，积极参与小管间质微炎症状态和纤维化。α-SMA是肾小球系膜细胞发生表型转化的重要标志，在多种增生性肾小球疾病中，肾小球系膜细胞α-SMA表达增强。
传统中药苦参，又名牛参或野槐，为斗科植物苦参的干燥根。其味苦性寒，入心、肝、胃、大肠、膀胱经。可清热躁湿、祛风、杀虫、利尿，据记载苦参主心脾气结、黄疸、溺有余沥、逐水、除痈肿，传统上用于治疗湿热痢疾、黄疸、脓疮等［2］。苦参的主要成分为苦参碱和氧化苦参碱。氧化苦参碱是苦参型生物碱的主要活性成分，有多方面的药理作用和功效，如抗菌、抗炎、抗纤维化、抗风湿、抗肿瘤、抗心律失常、消肿利尿、免疫及生物反应调节作用等［1］ ，有广阔的临床应用前景，特别是在抗组织纤维化治疗方面的作用，受到极大关注［6］。近年来，体内外研究发现，其具有明显抗肝纤维化的作用而广泛用于慢性肝病的临床治疗。大量研究表明，氧化苦参碱能抑制肝脏内、皮肤瘢痕组织内TGF-β1蛋白表达水平，从而达到抑制组织纤维化的作用［7］ 。张宏文等［8］在苦参碱对大鼠肾小球硬化早期防护作用的实验研究中发现，苦参碱可以通过直接抑制TGF-β1的表达，从而抑制肾小球固有细胞的活化、增殖及细胞外基质的分泌，起到抗肾小球硬化的作用。姚钢炼等［9］研究发现，氧化苦参碱可能是通过降低TGF-β1等细胞因子的表达而减少ECM产生细胞的活化，从而减少ECM的沉积而发挥抗肾脏纤维化的作用，并且可以抑制大鼠肾脏血管壁α-SMA表达而抑制表型转化作用。本研究发现，苦参素可以促进肾小球系膜细胞的增殖，在8.0 μmol/L的作用浓度以下，这种促增殖作用具有随浓度增加而增强的趋势，而当浓度大于8.0 μmol/L时，这种作用似有下降趋势。通过免疫组化检测发现，25 mg/L 浓度的苦参素作用24 h可以减少培养的人肾小球系膜细胞TGF-β1的表达，提示苦参素可通过减少培养的人肾小球系膜细胞TGF-β1合成的作用起到抗肾脏纤维化的作用。另外发现苦参素对α-SMA合成无明显影响，提示苦参素对体外培养的肾小球系膜细胞的表型转化无干预作用。
参考文献
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［7］ 余小虎，朱金水，俞华芳，等.氧化苦参碱抗大鼠肝纤维化及其免疫调控作用［J］.中国临床医学，2004，11(2):163-165.
［8］ 张宏文，金 玉.苦参碱对大鼠肾小球硬化早期防护作用的实验研究［J］.中华儿科杂志，2004，42(10):737-740.
［9］ 姚钢炼，宁 宁，高登峰，等.氧化苦参碱在大鼠肾间质纤维化进程中的保护作用［J］.西安交通大学学报(医学版)，2006，27(3):256-257.