作者：李东野 钱文浩 於江泉 夏勇 潘德锋 孙全胜 张中明
【摘要】 目的 探讨冬眠心肌细胞内TNF-α mRNA与心肌细胞凋亡的变化和意义，初步探索冬眠心肌形成的分子生物学机制。方法 行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者10例，术前1周内用多巴酚丁胺超声负荷试验（DSE）结合多普勒组织成像(DTI)确定冬眠心肌及正常心肌的存在部位，CABG术中根据检测结果进行取材（分别取正常心肌和冬眠心肌），并经电镜证实。取材心肌用 Tunel法检测心肌细胞凋亡情况，原位杂交法(ISH)测定TNF-α mRNA的活性。分析TNF-α mRNA与心肌细胞凋亡的关系。结果 冬眠心肌细胞凋亡数及TNF-α mRNA的表达较正常细胞高；TNF-α mRNA与冬眠心肌细胞凋亡数相关（r＝0.816，P＜0.05）。结论 心肌缺血缺氧时，心肌细胞内TNF-α分泌增加，TNF-α促进冬眠心肌的形成并诱导心肌细胞凋亡。
【关键词】 冬眠心肌；肿瘤坏死因子α；分子生物学机制
心肌冬眠(hibernating myocardium，HM)是心脏自动适应心肌慢性低灌注的一种反应，此时心肌灌注和心肌功能之间达到一种新的平衡。HM已成为近年来冠心病研究领域的热点之一，但迄今HM形成的确切机制尚不完全清楚。有研究发现，HM局部收缩功能与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)高表达呈负相关［1］，TNF-а的高表达可以促进动物心肌细胞凋亡。TNF-α的表达与冠心病患者HM凋亡之间的关系鲜见报道。本研究观察冠心病患者HM细胞的TNF-α mRNA表达，同时观察HM细胞凋亡情况。
1 材料和方法
1.1 实验材料 TNF-α mRNA原位杂交试剂盒、细胞凋亡试剂盒均购自武汉博士德生物公司。冠心病患者的心肌标本由徐州医学院附属医院胸心外科协助取材。
1.2 心肌标本来源 10例心肌标本均来自2004年8月—2006年3月在我院胸心外科行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者，冠状动脉造影至少有1支冠状动脉狭窄程度大于85%。男性7例，女性3例，平均年龄（58.3±4.24）岁。术中取HM及正常心肌（normal myocardium，NM）。
1.3 HM定位
1.3.1 采用多巴酚丁胺超声负荷试验(DSE)结合组织多普勒成像（DTI）技术。将左心室按美国超声心动图协会方法分为相对应的16个节段。
1.3.2 DSE检查方案 试验分为静息、多巴酚丁胺10 μg/(kg·min)、30 μg/(kg·min) 3个级别，每级负荷维持5 min，于每级负荷时记录超声图像，并记录常规12导联ECG和血压；终止指标为：出现心绞痛；收缩压&<80 mmHg或≥ 220 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）；出现严重心律失常；心率达到该患者年龄估算最高心率的85%；同一节段运动出现双相反应。
1.3.3 室壁节段运动异常的判定 DTI测量心肌收缩期峰值平均运动速度。如静息时平均运动速度低于正常速度，负荷10 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺时心肌运动速度较静息时明显增高，负荷30 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺时心肌运动速度反而减低，此时定义心肌运动呈双相反应，判定为HM。
1.4 心肌处理 4%戊二醛、10%甲醛（含0.1%焦碳酸二乙酯，DEPC）固定，在电子显微镜观察确认后分别进行ISH、Tunel试验。ISH法测TNF-α mRNA，Tunel法检测细胞凋亡。原位杂交及Tunel法均按试剂说明书进行操作。
原位杂交探针序列为：
（1）5′-GAGCA CTGAA AGCAT GATCC GGGAC GTGGA-3′
（2）5′-GAGTG ACAAG CCTGT AGCCC ATGTT GTAGC-3′
（3）5′-GGGCA GGTCT ACTTT GGGAT CATTG CCCTG-3′
1.5 统计学处理 计量数据以±s表示，统计软件采用SPSS 13.0，统计方法采用配对t检验。检验水准α＝0.05。
2 结 果
2.1 病理结果 电镜下(×12 000)可见HM与NM比较有以下一些特点：心肌纤维数量减少、稀疏，心肌纤维数量减少主要集中在细胞核周围。心肌纤维数量减少时细胞容量无变化（这一点与细胞萎缩不同）；心肌细胞内出现糖原积淀；心肌细胞内线粒体体积变小，散在分布于胞质内；细胞核扭曲，可见散在的异染色质；心肌细胞内没有发生小泡、水肿、染色体肿胀、细胞核崩解、脂质沉积等细胞坏死和萎缩时常见的变化。见图1A。
2.2 原位杂交结果 HM TNF-α mRNA胞质着色成棕黄色（图1B），原位杂交用Leica Qwin图像分析仪测定平均灰度值。HM组TNF-α胞质平均灰度值明显高于NM组(P＜0.05)。见表1。
2.3 心肌凋亡细胞计数 NM细胞核呈蓝色，而HM中凋亡心肌细胞核呈棕黄色（图1C）。在光学显微镜下计数5个高倍视野（HPF，×100）中凋亡阳性心肌细胞核数目求其均值，HM组阳性心肌细胞凋亡数明显高于NM组。见表1。
2.4 HM 组TNF-α mRNA表达水平与心肌细胞凋亡数的相关性 HM 组TNF-α mRNA胞质平均灰度值与心肌细胞凋亡数成正相关（r=0.816，P＜0.05）。 表1 2组TNF-α mRNA测定的灰度值及心肌细胞阳性凋亡数的比较
TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，人体包括心肌细胞在内的大部分细胞都能够合成TNF-α［3］，其参与介导多种疾病发生发展的病理生理过程。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，血管内皮细胞、平滑肌细胞也可合成释放。心肌也可分泌TNF-α，而且心肌细胞膜存在TNF-α受体。因此，心肌既是TNF-α的分泌场所，也是其作用的靶目标［4］。在生理状态下，TNF-α具有调节免疫应答、促进细胞生长分化、参与机体免疫反应等多种生物活性；在病理状态下则引起炎症反应、器官损害，使心肌细胞收缩力下降、心肌肥大及心肌细胞纤维化，最终导致心功能不全［5］。研究发现，TNF-α在心肌梗死患者心肌细胞凋亡中发挥介导作用［8］。Krown等［9］研究表明，TNF-α可使培养鼠的心肌细胞发生凋亡，且凋亡细胞数量与TNF-α浓度成正比。刘亮等［10］研究发现，缺血再灌注损伤和持续缺血可导致心肌细胞凋亡，抗TNF-α单克隆抗体预处理能明显减轻心肌细胞凋亡程度。本研究用DSE结合DTI的方法定位冠心病患者HM的部位成功取材，经电镜观察证实HM中TNF-α mRNA表达及心肌细胞凋亡数较正常心肌明显升高。TNF-α mRNA表达与与HM凋亡数目成正相关。表明心肌缺血缺氧时，心肌细胞内TNF-α分泌增加。TNF-α促进HM的形成，并可介导细胞凋亡。HM内凋亡细胞会影响心肌功能，而大量存在的凋亡细胞会使血运重建后的HM功能恢复受限。本研究表明，通过观察心肌TNF-α mRNA的表达，能间接反映冠心病患者HM细胞凋亡的水平，为临床是否进行血运重建治疗提供依据。 本研究的不足之处是：采用DSE结合DTI检测HM的方法尚达不到HM检测的“金标准”，但经过电镜证实也能达到准确诊断的要求。 另外就是所收集的病例数有限。TNF-α对敏感细胞的凋亡效应是通过与细胞膜上特异性TNF受体（TNFR，主要是TNFR1）结合后，触发丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导介导细胞凋亡。至于TNF-α表达促进MAPK活化介导细胞凋亡的具体过程目前尚不十分清楚，仍需进一步研究证实。
参考文献
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