作者：李晓娟，王培训，刘良，王文君，周联，梁瑞燕，曹柳英
【关键词】 青藤碱
摘要：【目的】研究青藤碱抗炎、抗风湿作用机理。【方法】采用小鼠巨噬细胞株J774体外培养，观察药物对该细胞株增殖、一氧化氮(NO)合成以及肿瘤坏死因子α信使核糖核酸(TNFα mRNA)表达及生物合成的影响。【结果】青藤碱能够抑制该细胞株增殖，抑制脂多糖(LPS)刺激状态下的NO合成；对TNFα蛋白合成具有抑制作用，但仅在高浓度时才对TNFα mRNA表达具有轻微的抑制作用。【结论】青藤碱可能通过下调单核／巨噬细胞系统炎症介质和细胞因子合成发挥抗炎、抗风湿作用。
关键词：关节炎，类风湿／中药疗法；青藤碱／药理学；细胞，培养的；一氧化氮；肿瘤坏死因子
青藤碱(sinomenine)是从中药青风藤中提取的一种单体生物碱，具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、镇静等多方面的药理作用［１］，临床用于治疗类风湿性关节炎(RA)等自身免疫性疾病疗效较好，且副作用小［2］。巨噬细胞在RA等自身免疫性疾病的发病中具有重要作用，有研究认为凡是对RA有效的治疗方法或药物均能下调单核／巨噬细胞系统的功能［3］。因此，我们选择了具有正常巨噬细胞显著特征的J774巨噬细胞株［4］，观察该药对其生长及炎症介质基因表达和生物合成的影响。
1 材料与方法
11 材料
111 J774巨噬细胞株
引自第一军医大学自由基教研室，来源于American Type Culture Collection(ATCC，美国)。细胞采用含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素、链霉素各1000U・L－１)传代培养，选择对数生长期的传代培养细胞用于实验。
112主要试剂
青藤碱纯品(原料药)由湖南正清制药公司提供；消炎痛(indomethacin)纯品，美国Cayman公司；胎牛血清，杭州四季青产品；RPMI 1640、DMEM培养基，美国GIBCO公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒和小鼠肿瘤坏死因子α(TNFα)检测试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；总核糖核酸(RNA)提取试剂盒和逆转录聚合酶链反应(Access RTPCR)试剂盒，Promega公司；脂多糖(LPS)和噻唑蓝(MTT)，Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。
12 方法
121 青藤碱对J774细胞增殖的影响
采用MTT法检测，方法参照文献［5，6］。
122 青藤碱对J774细胞株合成NO、TNFα的影响
细胞采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液培养，调整细胞浓度为１×１０９／Ｌ，加500μL入24孔板，贴壁3h后，每孔加含不同浓度青藤碱的培养液500μL，LPS 10μL(终浓度10mg/L)，继续培养24h，收集上清液，２０℃保存。按NO试剂盒(酶法)说明进行检测，cNO(μmol/L)＝Ｄ测定管／Ｄ标准管×１００μ mol/L；按TNFα检测试剂盒(ELISA法)说明检测ＴＮＦα浓度值(ng／Ｌ）。
123 细胞总RNA的提取
调整细胞浓度为１×１０９／Ｌ，每孔加2mL入6孔细胞培养板，贴壁2h后加LPS和不同浓度的青藤碱(LPS终浓度为10mg/L)，继续培养4h后提取细胞总RNA(操作按试剂盒说明进行)。
124 TNFα mRNA表达的检测
采用RTPCR法［7］，引物由上海生物工程公司合成，TNFα的引物为：5AGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAA3(Sense)， 5ACACCCATTCCCTTCACAGAGCAAT３（Ａntisense)(446bp)。以βactin作为内参。取8μL ＲＴＰＣＲ扩增反应产物＋２μＬ溴酚蓝加样缓冲液，15g/L琼脂糖电泳1h，溴乙锭(EB)染色30min后，UVP凝胶摄相仪照相分析结果。
2 结果
21 青藤碱对J774细胞增殖的影响
青藤碱和消炎痛对J774细胞株细胞增殖均具有显著的抑制作用，其半数抑制药物浓度分别约为1mmol/L和0094mmol/L(图1)。从细胞增殖结果分析，其后的实验设计青藤碱的浓度均采用c≤1mmol/L(低于或等于达到半数抑制率的药物浓度)。
22 青藤碱对J774细胞株一氧化氮(NO)合成的影响
青藤碱作用24h能够抑制LPS刺激状态下J774细胞合成NO，其半数抑制药物浓度约在500～1000μmol/L之间(图2)。
23 青藤碱对J774细胞株TNFα蛋白合成的影响
在625μmol/L、500μmol/L、1mmol/L浓度下，青藤碱能够显著抑制LPS刺激状态下TNFα蛋白合成，抑制率分别为2901%、4946%、9364%(图3)。
24 青藤碱对J774细胞株TNFα mRNA基因表达的影响
以LPS刺激J774细胞，培养2h，对TNFα mRNA表达的刺激作用轻微。青藤碱1mmol/L对不加或加LPS刺激状态下TNFα mRNA的表达具有轻微抑制作用，其抑制率分别为(125±65)%，(157±59)%（Ｐ＜００５，n=3）；但在100μmol/L、10μmol/L浓度下，青藤碱对LPS刺激状态下TNFα mRNA基因表达无明显影响(图4)。
NO自由基是一种在免疫调节、炎症介导中起重要作用的递质，在炎症反应中能够促使血管舒张、引起水肿、增加炎症性渗出、激活前列腺合酶等。RA病人血清和滑液中NO自由基水平均升高，提示NO作为一种炎症介质在RA发病中有重要作用。由于在RA炎症关节中巨噬细胞是NO合成的一个主要细胞群，青藤碱对巨噬细胞增殖及NO合成的影响可能对抑制RA病人滑膜炎症反应和过度炎症反应引起的氧化性损伤起到改善作用，这与文献的有关报道是一致的［８］。
由于滑膜内衬巨噬细胞样细胞在RA发病的早期和疾病的活动期能够无限地增殖，并且成为RA滑膜TNFα产生的主要细胞群；而TNFα可促进其他炎症性细胞因子、生长因子的合成，并可作用于成纤细胞和软骨细胞，在RA早期血管翳生成和后期骨破坏中起重要作用［9］。青藤碱对J774巨噬细胞增殖和TNFα合成的抑制作用说明，它可能对RA单核／巨噬细胞系统的亢奋状态具有一定的拮抗作用，而研究认为临床对RA有效的治疗均能下调单核／巨噬细胞系统功能［2］。故由此推测，青藤碱在临床上可能通过抑制滑膜内衬巨噬细胞样细胞恶性增殖及TNFα合成而对RA滑膜炎的发展进程具有一定程度的阻断作用，同时由于TNFα可促进NO的合成，故青藤碱抑制NO合成的作用可能部分通过抑制TNFα的合成而介导［10］。
另外，青藤碱对LPS刺激状态下TNFα蛋白合成有显著的抑制作用，但仅能轻微地抑制TNFα mRNA的表达，提示青藤碱作用的主要靶点可能在蛋白质合成水平，具体机制值得进一步深入研究。
参考文献
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