作者：罗小星， 王大伟， 赵永华， 梁坚
【关键词】 开心胶囊
摘要：【目的】观察开心胶囊对复苏犬心肌细胞免疫炎症因子基因表达的影响，以寻求阻止心肺复苏后向全身炎症反应综合征发展的有效手段。【方法】选用健康杂种犬15只，随机分为假手术组、模型组和开心胶囊组，每组5只；复制心肺复苏模型，在自主循环恢复180?min后处死动物，摘取心脏；提取心肌组织总RNA，采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测目的基因的信使核糖核酸(mRNA) 表达强度。【结果】模型组Toll样受体4（TLR4）和肿瘤坏死因子α（TNFα）mRNA的表达与假手术组比较有显著性差异（Ｐ＜００５）；开心胶囊组心肌组织TLR4 mRNA、TNFα mRNA和诱生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达受抑制，与模型组比较有显著性差异（Ｐ＜００５）。【结论】开心胶囊可能通过阻断或减弱免疫炎症因子基因的诱导，在一定程度上减轻复苏引起的心肌细胞的损伤。
关键词：开心胶囊／治疗应用；心肺复苏术； 细胞因子类；疾病模型，动物； 犬
心肺复苏后细胞因子的变化，最终可引起自身的免疫失控，导致全身炎症反应综合征（SIRS）的发生，在这种状态下，自身免疫失控所导致的损伤远远大于心肺复苏的损伤作用，是继发多器官衰竭（MODS）的重要原因［1］。
研究显示Toll样受体（Tolllike receptor，TLR）4，即TLR4作为跨膜受体在细菌内毒素介导的单核吞噬细胞免疫和炎症反应中发挥了重要作用［2］；而肿瘤坏死因子α（TNFα）与SIRS发病和死亡关系最密切，诱生型一氧化氮合酶（iNOS）在炎症时高度表达，催化NO（nitrioxide）大量合成，在SIRS的病理过程中发挥着广泛而复杂的作用。本实验采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法，观察开心胶囊(由西洋参、香附、苍术、川芎、山栀、五灵脂、蒲黄、神曲、山楂等组成)对TLR4、TNFα和iNOS的的信使核糖核酸（mRNA）表达的调节作用，现报告如下。
1 材料与方法
11 材料与仪器 TKR300 CG电脑射流供氧呼吸器（江西特力麻醉呼吸设备公司）；ID80普通成人用气管插管（浙江大学医疗医学仪器厂）；组织RNA抽提试剂盒（德国Invisorb公司）；Onestep RTPCR Kit（大连宝生物工程公司）；PRB 322 DNA/MSPI Markers（华美生物工程公司）；Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400；Beckman Allegra 64R台式高速冷冻离心机；DYY8B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；2FAI紫外透射分析仪（上海光明仪器厂）；Beckman DU640 核酸紫外分析仪；凝胶成相分析系统（美国Laconco公司）。
12 方法
121 动物 选用健康杂种犬15只，体质量13～15 kg，年龄2～3岁，雌雄不限，用30?g/L戊巴比妥钠（1?mL・kg-1）腹腔注射麻醉，气管插管。
122 分组 所有动物随机分为3组，每组5只。其中假手术组仅行开胸假手术处理；模型组开胸致颤后常规复苏；开心胶囊组实验前以开心胶囊（每粒045g，本院制剂室提供），按给药剂量01g/kg加生理盐水混匀稍加热成稀糊状，拌入犬当日一部分饲料中，为保证给药准确性，在犬吃完含中药的饲料后再添加剩余的饲料，连续喂养5?d后供实验用。开胸致颤后常规复苏，复苏后不使用任何血管活性物质。
123 模型复制与复苏 于胸骨左侧第5肋间开胸，至隐约可见到胸膜时，即接电脑射流供氧呼吸机行高频射氧通气；剪开心包，缝制简易心包吊床，暴露心脏，以低压交流电（3V、25?mA、01s）诱发室颤，同时停止机械通气；持续4?min后，恢复机械通气，直至自主循环建立；在恢复自主循环180?min后放血处死动物，迅速摘取心脏。
124 RTPCR操作方法 ①心肌细胞总RNA的提取及定量：按照Invisorb公司试剂盒提供的方法进行操作；②RTPCR扩增产物：利用 Genbank数据库中提供的iNOS （Accesion：AF077821）、TLR4（Accesion：AB080363）基因序列，并采用计算机引物设计软件Primer 3设计；TNFα、甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）则直接引用国外文献所提供的引物序列。iNOS引物：Sense 5AAGATGGTGCAGCAAAACAGC3，位于iNOS cDNA序列的3491～3512碱基，Antisense 5GGTGCAATCAGATGAAAGTGCC3，位于iNOS cDNA序列的3829～3850碱基，扩增产物长度为360 bp；TLR4引物：Sense 5GGTAAACCGTGGAGTCCAGA3，位于iNOS cDNA序列的2058～2078碱基，Antisense 5AACTCCATGAGGTTGGCATC3，位于iNOS cDNA序列的2244～2264碱基，扩增产物长度为207?bp；TNFα引物3］：Sense 5AAAGGACACCATGAGCACTGAAAGCATGATCC3，Antisense 5GAATTCTCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGAC3，扩增产物长度为719?bp；GAPDH引物［4］Sense 5TGCCCCCATGTTTGTGATG3，Antisense 5CCAGCCCCAGCGTCAAAGGTG3，扩增产物长度为519?bp；③PCR产物检测：15?g/L的琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析系统扫描记录结果，测定特异性条带的灰度与面积，以各自的灰度与面积的乘积表示互补DNA(cDNA)的量，再以同一反应体系中目的基因cDNA/GAPDH cDNA 量的比值表示目的基因mRNA 表达的相对强度。
2 结果
心肌组织TLR4、TNFα和iNOS mRNA的表达结果见表1，DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
表1 各组心肌组织TLR4、TNFα和iNOS mRNA表达的比较（略）
Table 1 Comparison of mRNA expression of TLR４，TNFα and iNOS in different groups
统计方法：q检验；与假手术组比较（vs group A）Ｐ＜００５；#与模型组比较（vs group A）Ｐ＜００５
a.TNFα mRNA
b.TLR4 mRNA
c.iNOS mRNA
1．标准对照（Marker）；2．假手术组（group A）；3．模型组（group B）；4．开心胶囊组（group C）
图1 各组心肌细胞TNFα、TLＲ４、iNOS mRNA表达电泳图谱（略）
Figure 1 Electrophoregram of mRNA expression of TNFα，TLR４ and iNOS in different groups
心肺复苏后由于机体启动了炎症反应系统如激活中性粒细胞、巨噬细胞而引起花生四烯酸和前列腺素等产物释放和氧自由基的产生，并刺激单核细胞释放TNFα等炎性因子，为了保证炎症因子不具有破坏性，很快出现抗炎反应。随着缺血再灌注损伤的加重， TNFα等促炎介质大量释放，促炎反应大于抗炎作用，产生SIRS。临床出现低血压、体温不正常等症状，最后可导致免疫失调，发生多脏器衰竭，这是复苏后死亡率居高不下的原因之一5］。
目前认为TLR４在机体炎症反应中占有重要地位，单核巨噬细胞表面的Toll样受体可作为革兰氏阴性菌内毒素（LPS）的位点识别受体，激活细胞内信号传导通路，促使合成一系列的细胞因子和炎症介质，进而诱发机体特异性免疫反应或SIRS，严重者可导致休克、MODS和死亡。随着研究的深入，发现TLR属于Ⅰ型跨膜蛋白，可与衔接蛋白MyD88结合，依次激活IL1受体相关激酶（IRAK）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、NFκB诱导激酶（NIK）和αβIκB激酶，最终使IκB磷酸化而降解，激活的NFκB移入核内，并结合在主要启动子和增强子的κB结合位点，激活免疫反应基因转录。而IL1受体和TNFα是引起炎症反应中的重要介质，提示TLR与炎症信号传导途径有着内在的联系6］。
TNFα是具有代表性的炎症介质，在炎性细胞因子中居于首位，并能刺激其他几种促炎性细胞的生成，可引起典型的SIRS，并导致MODS［7］。Yokoyama等［8］发现心肌在低氧应激情况下，不仅能合成TNFα mRNA，而且还合成TNFα蛋白质。TNFα对成熟的心肌细胞及乳头肌细胞有浓度依赖性的负性肌力作用，证实了体内TNF的水平与心功能之间有直接关系。另一些研究认为，TNF的负性肌力作用来源于细胞因子诱导iNOS合成，产生过多的ＮＯ，从而引起骨骼肌病变和内皮细胞凋亡，加重了外周系统的病变［9］。
鉴于TLR4在炎症反应中的作用以及在心肌细胞和微血管内皮细胞的广泛分布［10］，本实验观察了复苏后犬心肌细胞TLR4的表达，结果显示：心肺复苏后180?min，复苏犬心肌细胞中的TLR4 mRNA表达高于假手术组，表明复苏的刺激可促进心肌细胞TLR4基因表达，而且，重要致炎介质TNFα和iNOS的基因表达均增加，而给予中药开心胶囊可以抑制TNFα和iNOS的诱生和TLR4 mRNA的表达，在一定程度上减轻复苏引起的心肌细胞的损伤。三者之间是否存在某种相互作用的关系，有待进一步研究。
参考文献
［1］Luce J M．Acute lung injury and the acute respiratory disease syndrome［J］． Crit Care Med， 1998， 26（2）:369．
［2］Henneke P， Golenbock D T． Innate immune recognition of lipopolysaccharide by endothelial cells［J］． Crit Care Med， 2002， 30（5 Suppl）:207．
［3］Fulton D， Papapetropoulos A， Zhang X， et al． Quantification of eNOS mRNA in the canine cardiac vasculature by competitive PCR［J］． Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2000， 278（2）:658．
［4］Guest T M， Ramnanathan A V， Tuteur PG， et al． Myocardial injury in critically ill patients． A frequently unrecognized complication［J］． JAMA， 1995， 273（24）: 1945．
［5］Geppert A， Zorn G， Karth G D， et al． Soluble selectins and the systemic inflmmatory response syndrome after successful cardiopulmonary resuscitation［J］． Crit Care Med， 2000， 28（7）:2360．
［6］Poltorak A， He X， Smirnova I， et al． Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene［J］．Science，1998， 282（5396）:2085．
［7］任成山，毛宝龄．SIRS和MODS的研究现状与展望［J］．中国危重病急救医学，1999，11（8）：498．
［8］Yokoyama T， Vaca L， Rossen R D， et al． Cellular basis for the negative inotropic effects of tumor necrosis factoralpha in the adult mammalian heart［J］． J Clin Invest， 1993， 92（5）:2303．
［9］Balligand J L， UngureanuLongrois D， Simmons W W， et al． Induction of NO synthase in rat cardiac microvascular endothelial cells by IL1 beta and IFNgamma ［J］． Am J Physiol， 1995， 268．H1293．
［10］Stefan F，Leater K，Yong D K， et al．Toll4(TLR4) expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium［J］．J Clin Invest，1999，104:271．