作者：罗承锋，黄衍寿，刘月婵，冼绍祥，洪永敦，刘煜德
【关键词】 心室肌细胞
摘要：【目的】观察腹主动脉缩窄造成的压力超负荷大鼠模型左心室肌细胞B细胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成员Bax蛋白表达的序列变化。【方法】压力超负荷大鼠各时间点(造模后1、4、7、10、21、30、40d)Bax、Bcl2蛋白的表达用流式细胞仪进行胞内抗原定量检测。【结果】在腹主动脉缩窄之后第1天，大鼠左心室肌细胞Bax蛋白的表达率较高(6375%)，Bcl2蛋白的表达率则较低(3145%)，Bax/Bcl２较高(202)；在以后的观察点中，Bax蛋白的表达率变化不大，波动于50%～60%之间，而Bcl2蛋白的表达则于第7天升至最高值(7175%)，尔后开始下降，第30天时其表达率最低(228%)；Bax/Bcl2于第4天时下降，第7天时降至最低，随后开始逐渐上升，第30天达到峰值(24)，到第40天时又下降。【结论】腹主动脉缩窄造成的压力超负荷大鼠模型左心室肌细胞凋亡发生的高峰可能在造模后的第30天。
关键词：细胞凋亡；心力衰竭，充血性/病因学；疾病模型，动物；大鼠
Bing在1994年就提出细胞凋亡是慢性压力超负荷导致心力衰竭的机制的假说［１］。越来越多的证据表明，压力超负荷时存在着心肌细胞凋亡。B细胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成员Bax蛋白在细胞凋亡的调控过程中起着重要的作用。笔者对压力超负荷大鼠心室肌细胞Bax、Bcl2蛋白的表达规律进行了研究。
1 材料与方法
11 动物及分组
普通级SD大鼠24只，雌性，体重180～220g，购自广州中医药大学实验动物中心，随机分为8组，即大鼠造模后第1、4、7、10、14、21、30、40d 8个时间点，每组各3只。
12 主要器材与试剂
牙用不锈钢丝(上海牙科医械厂，批号：K41701)；分析天平(LIBROR AEU210，Shimadzu)；抽滤器(NALGENE，Nalge Company)；离心机(LD52A，北京医用离心机厂)；光学显微镜(Bh3，Olympus)；流式细胞仪(EPICS ALTRA，Beckman Coulter)。Ficoll(Sigma，华美生物工程公司分装，批号：38H0588)；多聚甲醛(广州化学试剂厂，批号：99010136)；小鼠抗大鼠Bax Ab4(6A7)(Neomarkers，批号：714P010)；小鼠抗大鼠Bcl2α Ab4(10C4)(Neomarkers，批号：598P111)；藻红蛋白(RPE)标记的羊抗小鼠F(ab′)2IgG(Serotec，批号：280901)；封闭用羊血清(北京中山生物技术有限公司，批号：ZLI9021)；RPE标记的羊F(ab′)2IgG(Southern Biotechnology Associate Inc，批号：J366W490B)。
13 心衰模型的复制
以腹主动脉缩窄法复制大鼠左心室压力超负荷模型［２］。给大鼠腹腔注射100g・L－１水合氯醛，剂量35mL・kg－１，麻醉后，暴露腹主动脉，并于双侧肾动脉上方钝性分离腹主动脉，用4号缝合线将腹主动脉和与腹主动脉平行放置的外径约06～09mm的牙用不锈钢丝一并结扎，然后轻轻取出不锈钢丝，使腹主动脉截面积缩窄至原来的25%～30%左右，造成腹主动脉狭窄，关腹。假手术组，钝性分离腹主动脉后，缝合线仅绕于腹主动脉上，并不缩窄，且在术后3d内给予肌肉注射青霉素(18000U・kg－１），以预防感染。
14 取材
大鼠称体重(mbody)后，麻醉，开胸，迅速取出心脏，分别称取整个心脏质量(mheart)及左心室的质量(mLV)，将左心室剪成两块，用针将心肌穿孔；置于含600mL・L－１甘油的DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium)的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用。
15 心肌细胞的分离与纯化［３］
从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻；用DMEM清洗心脏；将左心室剪碎成1mm３的小块，于KrebsHenseleit液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复1次；将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800r/min离心5min，01mol・L－１磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，800r/min离心5min；将沉淀轻轻加入40g・L－１的Ficoll上，400r/min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状的心肌细胞。
16 Bax、Bcl2蛋白的检测［４，５］
将所分离出的心肌细胞计数，各取1×１０６个细胞，分别加入4支试管中；40g・L－１多聚甲醛固定60min，1500r/min离心，弃上清，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L－１ Tween80中30min，1500r/min离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL，20min，5mL・L－１ Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入100μL 1∶100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL・L－１ Tween80孵育5～10min，1500r/min离心，PBS清洗2次；每试管中加入5μL RPE标记的羊抗小鼠抗体或10μL RPE标记的羊抗小鼠的同型对照，室温下孵育30min，加入5mL・L－１Tween80孵育5～10min，1500r/min离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS 400μL，待上机检测。
使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。
2 实验结果
21 造模结果
24只大鼠中死亡8只，死亡大鼠均于3d内死于急性左心衰，解剖发现双肺明显瘀血，部分还伴有胸腔积液，其死亡与急性压力超负荷有关。
从图1和图2可以看出，大鼠在造模后心脏质量(mheart)、左心室的质量(mLV)逐渐增加，第30～40天之间，其增幅有所减少；心脏、左心室质量与体重之比，即心脏质量指数(CMI，IＣＭ＝mheart/mbody)、左心室质量指数(LVMI，IＬＶ＝mLV/mbody)，亦随时间的延长而增加，约于第30天达到最高值，可能与后负荷增加引起的代偿性肥厚有关，到第40天时，二者的比值已开始降低。
23 各时间点心肌细胞中Bax、Bcl2的表达情况
从图3～5可以看出，在腹主动脉缩窄后第1天，大鼠左心室心肌细胞Bax蛋白的表达率较高(6375%)，第4天已下降，在以后的时间中，其表达率变化不大，波动于50%～60%之间；Bcl2蛋白的表达率于第1天时较低(3145%)，随后上升，第7天升至最高值(7175%)，尔后开始下降，第30天时其表达率最低(228%)；RBax/RBcl2于第1天时较高，第4天时已下降，第7天时降至最低，随后开始逐渐上升，第30天达到峰值(24)，到第40天时又下降，两者荧光强度比值的序列变化基本与表达率之比相似，其第1天的变化可能与突然的压力超负荷有关。
3 讨论
心脏的压力超负荷情况下，心脏首先代偿性地向心性肥厚，随后，心肌细胞增长，心室腔的扩大，心室几何形态的变化，心肌细胞外间质发生胶原沉积和纤维化，即心室重塑，最终因失代偿而发生心衰，在此过程中心功能的进行性恶化可能与心肌细胞凋亡有关［１，６］。细胞凋亡受到程序控制，Bcl2和Bax是Bcl2家族中的重要成员，Bcl2蛋白抑制细胞凋亡，而Bax蛋白则促进细胞凋亡。Bcl2、Bax蛋白可形成同源二聚体，也可相互间形成异源二聚体，Bcl2与Bax的比例(RBcl2/RBax)决定细胞是否发生凋亡，尽管细胞内这一比例是固定的，但外界刺激可以改变抑制凋亡的Bcl2Bax与促进凋亡的BaxBax的量发生改变。随着Bcl2表达的增多，BaxBax分开，形成Bcl2Bax异源二聚体，若细胞中50%的Bax与Bcl2形成异源二聚体，即凋亡受抑；若80%的Bax以同源二聚体的形式存在，则细胞容易发生凋亡［７］。研究显示，当RBax/RBcl2＞2时，细胞凋亡，反之则存活。也有研究表明，Bcl2和Bax可独立地调节细胞凋亡。本文对腹主动脉缩窄引起的压力超负荷大鼠心室肌细胞表达Bax和Bcl2蛋白的规律进行了研究，发现腹主动脉缩窄后第30天时大鼠左心室肌细胞Bcl2表达率最低(228%)；RBax/RBcl2比值最高(24)，压力超负荷大鼠心肌细胞凋亡发生的高峰可能在第30天。有研究者用缩窄50g体重的雌性Wistar大鼠的升主动脉，造成急性压力负荷，用DNA ladder和共聚焦显微镜观察心肌细胞的凋亡情况，发现缩窄后心肌细胞即发生凋亡，第4天达到高峰，30d后恢复正常［８］，与本研究结果有所不同，这是否与大鼠年龄、体重及缩窄部位等因素不同有关，有待于进一步研究证实。但了解压力超负荷心脏的心肌细胞凋亡规律可为药物的有效干预提供依据。
参考文献：
［１］Bing O H L.Hypothesis:Apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload［Ｊ］．J Mol Cell Cardiol，1994，26:943.
［２］Chang K C，Shreur J N，Weiner M W，et al.Impaired Ca２＋ remodeling is an early manifestation of pressureoverload hypertrophy in rat hearts［Ｊ］．Am J Physiol，1996，271(1 pt 2):h328.
［３］黄衍寿，洪永敦，罗承锋，等．成年大鼠心室肌细胞的超低温液氮保存分离法［Ｊ］．广州中医药大学学报，2002，19(4)：289．
［４］Dragowska W H，Menezes D E L，Sartor J，et al.Quantitative fluorescence cytometric analysis of Bcl2 levels in tumor cells exhibiting a wide range of inherent Bcl2 protein expression:correlation with western blot analysis［Ｊ］．Cytometry，2000，10:346.
［５］Stewart C C.Flow cytometric analysis of oncogene expression in human neoplasis［Ｊ］．Arch Pathol Lab Med，1989，113:634.
［６］Sabbah H N，Shsrov V G.Apoptosis in heart failure［Ｊ］．Prog Cardiovasc Dis，1998，40:549.
［７］Oltvai Z N，Milliman C L，Korsmeyer S J.Bcl2 heterodimerizes in vivo with a conserved homologen，Bax，that accelerates programmed cell death［Ｊ］．Cell，1993，74(4):609.
［８］Teiget E，Dam T V，Richard L，et al.Apoptosis in pressure overload induced heart hypertrophy in the rat［Ｊ］．