川芎提取物对神经根型颈椎病模型大鼠根性疼痛的保护作用分析

　　　　 作者：谢炜，赵伟宏，于林，鲍勇

【摘要】 目的 探讨川芎提取物治疗神经根型颈椎病大鼠神经根性疼痛的作用及机制。方法 通过改良椎管插线方法建立神经根型颈椎病大鼠神经根性疼痛模型。将大鼠随机分为5组：川芎高、中、低剂量组，模型组，颈复康组，每组8只。干预前及干预后10 d分别进行疼痛行为及步态评估、左正中神经体感诱发电位（SEP）测量；干预结束后取受损颈髓及神经根组织，进行病理切片，观察形态学变化。结果 川芎高、中、低剂量灌胃给药后，可以明显改善模型大鼠根性疼痛的相关行为，恢复受损神经SEP的潜伏期、波幅及传导速度等，与模型组相比差异有显著性（P&<0.05），并可发挥神经保护作用，减轻受损神经根的水肿变性、髓鞘脱失等损伤。结论 川芎提取物可以明显减轻模型大鼠的颈神经根性疼痛，其作用可能与神经保护作用有关。
【关键词】 川芎；质量控制；颈神经根性痛；诱发电位
Abstract:Objective To study the effect and mechanism of extract of Rhizoma Chuanxiong on rat with cervical root pain.Methods The models of rats with cervical root pain were established by modified buried suture in vertebral canal. The rats were randomly pided into 5 groups (8 rats in each group): the three groups administered with extract of Rhizoma Chuanxiong at low， moderate and high doses respectively， model group， and the group administered with Jingfukang granules. Before and 10 days after treatment， neuropathic pain behaviors were evaluated， and the left median nerve somatosensory evoked potentials were measured; and after the treatment， the cervical nerve roots were taken for pathological section and morphological analysis.Results The groups administered with extract of Rhizoma Chuanxiong at high and moderate doses showed significant effects on painrelated behavior scores and recovery of SEP data (latence， amplitude， conduction of velocity). There were significant differences compared with model group（P&<0.05）， and neuroprotective effect can be saw in the groups administered with extract of Rhizoma Chuanxiong with hydropic degeneration and demyelination of nerve root were relieved.Conclusion The extract of Rhizoma Chuanxiong showed therapeutic effects on cervical root pain， which might be correlated with the neuroprotective effect.
　　Key words:Rhizoma Chuanxiong；quality control；cervical radicular neuralgia；somatosensory evoked potentials
　　神经根型颈椎病占颈椎病人群的总患病率的50%～60%［1］，其主要症状是颈神经根性疼痛(radicular neuralgia)、麻木、上肢无力等，其发病可能与脊神经根特别是背根神经节受到机械压迫和炎症刺激，以致发生慢性损伤有关。中医理论认为其发病多由于瘀血阻络、不通而痛。而川芎性辛温，为“血中之气药”，其小剂量能祛风止痛，中剂量行气活血止痛，大剂量通络止痛［2］。许多临床研究表明，川芎及其制剂能有效治疗颈神经根性疼痛，但其机制尚不完全清楚。本研究拟对大鼠颈神经根性疼痛的行为学、受损神经的体感诱发电位以及相关颈髓与神经根形态学的变化进行观察，探讨川芎提取物对神经根型颈椎病大鼠模型根性疼痛的治疗作用及机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 药材、试剂及仪器
　　川芎饮片购于广东广弘药材公司，经南方医科大学中药教研室彭康教授鉴定为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）经炮制后的饮片；颈复康颗粒由承德颈复康药业集团有限公司生产（批号：20070521）；阿魏酸(ferulaic acid，FA)对照品(中国药品生物制品检定所，批号：07739910)用于检测川芎提取物中的阿魏酸含量；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；其余均为分析纯试剂。高效液相色谱仪（Agilent公司），CP225D电子天平（德国Sartorius）；ADinstruments公司十六通道生理信号采集仪（ML880 PowerLab 16/30）、双通道生物电放大器/刺激器（ML408 Dual Bio AmpStimulator）；Olympus摄影显微镜；无菌手术包、渔线、针灸针等。
　　1.2 川芎提取物的制备及阿魏酸含量测定
　　1.2.1 川芎提取物的制备方法
　　川芎饮片加入8倍量水，不泡，冷凝回流水提4 h，收集挥发油备用；其煎液经过滤、减压浓缩至100％后，加入挥发油混匀，1∶1定容。
　　1.2.2 川芎提取物中阿魏酸含量 精密量取1 mL川芎提取液稀释定容于10 mL容量瓶中，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过后取续滤液。采用HPLC法测定阿魏酸（FA）含量，经方法学考察，包括线性范围、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率测定等步骤，最终测得川芎提取液（1∶1）中FA的含量为45.04 mg·mL-1。
　　1.3 实验动物及模型的建立
　　1.3.1 实验动物 健康SPF级SD大鼠54只，体质量200～220 g，雌雄各半，由南方医科大学动物实验中心提供（合格证号：2006B023）；笼内饲养，室温(25±1) ℃，每日12 h白天/黑夜循环。
1.3.2 神经根型颈椎病大鼠模型 参照文献［3］椎管插线法，略作改进。C7椎板左侧开窗后，以2根各长8 mm、直径0.55 mm的尼龙渔线，分别沿脊髓纵轴放置在C4～C7、C6～T1脊神经根腋下。术中及术后共死亡4只。余50只大鼠在术后第5天接受相关评价入组。
　　1.4 动物分组及干预
　　所有大鼠在造模术前行左侧正中神经体感诱发电位(short latency somatosensory evoked potential，SLSEP)检测，获取正常参考值。术后第5天进行筛选，符合以下条件：①造模前后术侧E′C6 Lat的增长为0.2～0.4 ms；②步态评分为2～3分（见“行为学观察”），无脊髓压迫症状，共42只大鼠符合要求。随机抽取40只大鼠进入实验，并随机分为5个处理组，即模型组、颈复康组、川芎高、中、低剂量组，每组8只。其中模型组灌胃生理盐水；颈复康组灌胃颈复康颗粒溶液1 g·kg-1·d-1；川芎高、中、低剂量组各灌胃给予5.6、2.8、1.4 g·kg-1·d-1（相当于体质量60 kg的成人每日60 g、30 g、15 g的用量），分别相当于FA的含量为252.2、126.1、63.05 mg·kg-1 ·d-1。各组灌胃每日1次，连续10 d，所有组别灌胃时均调整至相同容积。
　　1.5 模型评价
　　1.5.1　　自发痛、步态评估及行为学观察 每日在9：00～10：30间将大鼠放置在观察箱中，适应30 min后观察有无自噬、舔咬、嘶叫等行为。进行自发痛评估，即记录5 min内左前肢离地的累积时间，取3次平均值作为大鼠左前肢自发痛指标。结合Kawakami与Dubuisson法对其由疼痛挛缩造成的步态障碍进行评估，其中正常步态、足无畸形计为1分；受损伤足轻触玻璃台面、不持重或轻微持重、走时跛行或足内收蜷缩畸形计为2分；受损足抬起蜷缩、走动时不着台面计为3分。
　　　1.5.2　体感诱发电位测定 参考有关文献［4］，检测大鼠造模前后左侧正中神经体感诱发电位，记录并计算术侧锁骨上窝(Erb’s)点与C6椎板上点潜伏期的差值（E’C6 Lat）、C6椎板上点波幅(C6 Amp)，计算感觉电位传导速度(MCV)，每次测量重复两次取其平均值。
　　1.5.3　颈髓及神经根病理结构观察 方法

参考文献

［4］，取压线段颈髓及神经根，常规处理，石蜡包埋、切片，行HE染色，在光镜下（10×20倍）观察，每鼠颈髓标本随机取3张切片，每张切片随机取5个视野，分别统计各组出现神经细胞空泡样变、坏死灶、轴突扭曲髓鞘脱失呈鱼骨状等阳性病变的例数。
　　1.6 统计学处理
　　计量数据以均数±标准差(±s)表示，使用SPSS11.5行单因素方差分析，组间比较用LSD法处理，以P&<0.05为差异有显著性。
　　2 结 果
　　2.1 行为学观察
　　实验大鼠无脱失，均进入实验数据分析。各组大鼠无明显体质量减轻，伤口无脓性分泌物，愈合良好，无自噬及舔咬等现象。
　　2.2 川芎提取物对模型大鼠自发痛及步态评分的影响
　　给予相应干预后，川芎高、中、低剂量组均能明显缩短其左前肢的离地时间，减轻其自发痛，改善步态障碍，与模型组相比差异有显著性（P&<0.05）。干预前后自发痛评分的变化，川芎高剂量组作用强于低剂量组，两组差异有统计学意义（P&<0.05），与颈复康组相当。见表1。表1 各组大鼠干预前后自发痛及步态评分比较与模型组比较：▲P&<0.05；与颈复康组比较：△P&<0.05；与高剂量组比较：﹡P&<0.05
　　2.3 川芎提取物对模型大鼠正中神经体感诱发电位的影响

转贴于 　　川芎高、中、低剂量组能明显缩短正中神经体感诱发电位的潜伏期（E’C6 Lat），增加其波幅（C6 Amp），干预前后的差值变化与模型组相比，差异有显著性（P&<0.05），尤以川芎高剂量组作用更强，与颈复康组作用相当（P&>0.05）。川芎各剂量组也能明显提高其电位传导速度（MCV），干预前后的速度变化差值与模型组相比，差异有显著性（P&<0.05），以川芎高剂量组作用更明显，与颈复康组作用相当（P&>0.05）。见表2。
　　2.4 川芎提取物对模型大鼠颈髓及神经根病理形态改变的影响
　　大鼠颈神经根组织病理形态学观察，模型组出现明显水肿变性、髓鞘脱失等损伤表现；川芎各剂量组及颈复康组大鼠的颈神经根损伤程度较轻，出现神经节细胞空泡变性、坏死及髓鞘鱼骨样变的例数较少。见表3。表2 各组大鼠干预前后正中神经诱发电位潜伏期、波幅、传导速度差值比较 与模型组比较：▲P&<0.05；与颈复康组比较：△P&<0.05；与高剂量组比较：﹡P&<0.05表3 各组大鼠干预后颈髓及神经根病理形态变化
　　3 讨 论
　　神经根型颈椎病根性疼痛的发病机制主要与机械压迫、生物化学及疼痛产生因素3个方面有关，神经根受损后产生的自发痛、放射痛是神经根压迫病人的突出症状。疼痛的产生一方面由于机械压力和炎症因子直接兴奋背根节伤害性感受器；另一方面，基于神经根处缺乏神经外膜、束膜保护，血-神经屏障不完善的结构特点，使神经根易于受到损害。受损的背根节细胞与髓鞘脱失处的纤维异常放电，合成多种疼痛递质，产生自发痛和痛觉过敏［4］，节细胞数目的减少则使感觉障碍难以恢复。而正中神经体感诱发电位（SLSEP）在神经根型颈椎病根性疼痛患者及动物模型中都是敏感、精确地评价颈神经通路结构完整和功能的早期诊断与判断预后的指标。当神经元膜环境的改变导致Na+、Ca2+内流出现细胞毒性水肿甚至坏死、凋亡［3］；而神经营养障碍及自由基对鞘磷脂的攻击，都会导致髓鞘受损，SLSEP传导减弱。SLSEP的传导减弱可以提示神经根的损伤程度，与根性痛的产生密切相关［5］。
　　本实验对川芎饮片应用传统水提法，提供包括内酯类（挥发油）、酚酸类（FA等）、生物碱（川芎嗪等）等多种川芎内活性成分，选用含量较高且性质稳定、HPLC法检测灵敏的阿魏酸［6］，作为定量指标；采用了椎管插线法造模［7］，通过局部压迫方法建立稳定的神经根型颈椎病大鼠模型，以表现其根性疼痛，探讨了川芎提取物对模型大鼠自发痛和因疼痛挛缩造成的步态障碍的影响，并进一步研究了SLSEP的相关指标和神经根病理形态的变化。发现神经根型颈椎病模型大鼠通过模型中机械压迫，可以造成根性自发疼痛，大鼠损伤侧前肢不敢触地，步态明显障碍，行走时跛行或足内收蜷缩畸形，甚至受损足抬起蜷缩、走动时不着台面；SLSEP检测提示其潜伏期明显延长，波幅降低，传导速度减慢；同时神经根出现明显水肿变性、髓鞘脱失等损伤。而当给予的川芎提取物（有效成分）中FA剂量为252.2（高剂量）、126（中剂量）、63.05（低剂量）mg·kg-1·d-1灌胃10 d后，可以明显减轻大鼠左前肢的自发痛，改善其步态，并缩短大鼠受损神经SLSEP的潜伏期，增高其波幅，加快其传导速度，并且存在一定的量效关系，以高剂量组作用较好。提示川芎对受损神经的轴突髓鞘及神经细胞可能存在保护作用，从而抑制其根性疼痛的产生和持续。通过对受损神经根的病理形态观察，也证实了川芎各剂量组的大鼠神经元及髓鞘结构较模型组完整，对受损神经根有较好的保护作用，为临床应用川芎治疗神经根型颈椎病根性痛提供了实验依据。推测其可能机制在于川芎内有效物质具有改善微循环、改善神经营养供应、促进水肿消退的作用；也存在拮抗自由基对细胞膜脂质及鞘磷脂的损伤，阻止神经细胞膜通透性的改变［8］，提高Ca2+Mg2+ATP酶的活性，抑制钙离子内流，保护了线粒体功能；或者抑制了神经细胞伤害性Na+、K+电流等来发挥神经元保护作用［9］，从而阻止病变发展，有利于受损组织修复。其具体作用机制有待进一步研究。
【参考文献】
［1］ 王冰，段义萍，张友常，等.颈椎病患病特征的流行病学研究［J］.中南大学学报：医学版，2004，29(4):472-474.

［2］ 李远，贾波.浅谈剂量对川芎功效的影响［J］.四川中医，2005，23(1):25-26.

［3］ WINKELSTEIN B A，WEINSTIN J N，DELEO J A. The role of mechanical deformation in lumbar radiculopathy: an in vivo model. ［J］.Spine，2002， 27(1):27-33.

［4］ KOBAYASHI S， YOSHIZAWA H. Effect of mechanical compression on the vascular permeability of the dorsal root ganglion［J］ .J Orthop Res， 2002(20):730-739.

［5］ 马越，党耕町，刘忠军，等. 神经电生理检查对神经根型颈椎病与肘管综合征的鉴别诊断价值［J］. 中国脊柱脊髓杂志，2006，16（9）：652-654.

［6］ WOOLF C J， COSTIGAN M. Transcriptional and posttranslational plasticity and the generation of inflammatory pain［J］ . Proc Natl Acad Sci USA，1999，96: 7723-7730.

［7］ 窦夏睿，孙建宁，王威，等. 急性期神经根型颈椎病模型的建立［J］.北京中医药大学学报，2006，29(5):332.

［8］ 胡益勇，徐晓玉.阿魏酸的化学和药理研究进展［J］.中成药，2006，28（2）：253-255.

［9］ 欧仕益，包惠燕，蓝志东. 阿魏酸及其衍生物的药理作用研究进展［J］.中药材，2001，24(3):220-221.