通脉软胶囊质量标准分析

　　　　　　作者：冯素香 谢彩侠 王淑美 梁生旺 张志平

【摘要】 目的 建立通脉软胶囊的质量标准。方法 采用TLC法对处方中人参、冰片进行了定性鉴别；采用HPLC法对方中的人参皂苷Rg1、Re、Rb1进行了含量测定。结果 本品定性鉴别薄层色谱特征明显，专属性强；平均回收率:人参皂苷Rg1为 98.40%，RSD=1.88%；Re为98.21%，RSD=1.94%；Rb1为98.48%，RSD=1.42%。结论 薄层色谱鉴别和含量测定方法准确可行、重复性好、方法简便，可作为通脉软胶囊的质量控制方法。
【关键词】 通脉软胶囊；TLC；HPLC；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；质量标准
Abstract:Objective To establish the quality standard for Tongmai softgel capsules. Methods Panax ginseng and borneol were identified with TLC; and Ginsenoside Rg1， Re， Rb1 in the capsules were assayed by HPLC. Results The TLC characteristic for identification by TLC was distinct and highly specific. The average recovery rate: Ginsenoside Rg1: 98.40%， RSD=1.88%; Re: 98.21%， RSD=1.94%; Rb1:98.48%， RSD=1.42%.Conclusion The identification and quantification methods were accurate， reliable， and repeatable， which might be used in the quality control of Tongmai softgel capsules.
　　Key words:Tongmai softgel capsules; TLC; HPLC; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Re; Ginsenoside Rb1; quality standard
　　通脉软胶囊为中药6类新药，已被SFDA批准进行临床研究。由人参、冰片等6味中药组成，具有益气化瘀、活血通脉的功能，主治冠心病、心绞痛等。为了保证产品的安全性、有效性及质量可控性，我们采用薄层色谱法对人参、冰片进行了定性鉴别。人参为方中君药，其主要成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1等。为了更有效地控制产品质量，本文建立用HPLC梯度洗脱法同时测定通脉软胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量［1-3］。结果表明，本法操作简便、重现性好、测定结果准确，能作为通脉软胶囊的质量控制的方法。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　LC2010A高效液相色谱仪（日本岛津），SPDM10Avp二极管阵列检测器（日本岛津）；BSZZ4S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
　　1.2 试药
　　人参皂苷Rg1对照品(批号:703200221)、人参皂苷Re对照品(批号:754200115)、人参皂苷Rb1对照品(批号:704200318)均购自中国药品生物制品检定所；通脉软胶囊（自制，批号:060811、060812、060813，规格为0.6 g/粒）
　　2 方法与结果
　　2.1 通脉软胶囊的薄层鉴别
　　2.1.1 冰片 取本品2粒，剪开，置烧杯中，用水洗涤3次，每次15 mL，转入分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次15 mL，合并正己烷液，用甲醇20 mL萃取，弃去正己烷溶液，甲醇液蒸至约2 mL，转入5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取冰片对照品，加醋酸乙酯溶解，制成每1 mL含5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录VI B）试验，吸取对照品溶液及供试品溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯正己烷（体积比9∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照色谱中无相应斑点出现，见图1。
　　2.1.2 人参 取本品5粒，剪开，加温水(40～50 ℃)洗涤3次，每次15 mL，加乙醚30 mL洗涤，并入分液漏斗中，弃去乙醚液，再加乙醚30 mL萃取，弃去乙醚液，水溶液加水饱和正丁醇萃取4次（20 mL，20 mL，15 mL，15 mL），合并正丁醇液，加1% NaOH溶液洗涤2次，每次30 mL，弃去碱液，再加用正丁醇饱和的水溶液洗涤2次，每次20 mL，收集正丁醇液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取人参皂苷Rg1和Re对照品，加甲醇制成每 mL各含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。另取人参对照药材1 g，加三氯甲烷40 mL，加热回流1 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，用水0.5 mL拌匀湿润后，加水饱和的正丁醇10 mL，超声处理30 min，吸取上清液，加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录VI B）试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液各4 μL及供试品溶液6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷甲醇水（体积比13∶7∶2）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘约5 min。供试品色谱中，在与对照品色谱、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性色谱中无对应斑点出现，见图1。
　　1-3.供试品;4.人参对照药材;5.人参皂苷Rg1对照品;6.人参皂苷Re对照品;7.缺人参的阴性对照
　　图1 冰片与人参的薄层色谱鉴别图
　　Fig.1 TLC chromatogram of borneol and Panax ginseng2.2 人参皂苷的含量测定
　　2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取以五氧化二磷干燥至恒重的人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、适量，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液，混匀即得（浓度分别为：人参皂苷Rg1 0.596 mg/mL；人参皂苷Re：0.452 mg/mL；人参皂苷Rb1：0.548 mg/mL）。

转贴于 2.2.2 供试品溶液的制备　　 取本品5粒，剪开，加温水(40～50 ℃)洗涤5次，每次10 mL，加乙醚20 mL洗涤，并入分液漏斗中，弃去乙醚液，再加乙醚20 mL萃取，弃去乙醚液，水溶液用水饱和的正丁醇提取5次（20 mL，20 mL，20 mL，15 mL，15 mL），合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20 mL，弃去碱液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 mL，收集正丁醇液，置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过， 作为供试品溶液。
　　2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方比例分别称取除人参外其他药材适量，按软胶囊制备工艺制得缺人参的阴性样品，照供试品溶液制备项下方法制备阴性样品溶液。
　　2.2.4 色谱条件与系统适用性试验［2］ 色谱柱：Hypersil BDS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱（大连依利特）；流动相：乙腈（A）水（B）梯度洗脱（B%为80→72→70→80，相应时间周期为0→60→100→120 min）；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰和人参皂苷Rb1峰计算应分别不低于5 000。
　　分别吸取供试品溶液、阴性对照溶液及对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。记录其HPLC液相色谱图，结果表明人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1色谱峰分离良好，且阴性样品溶液无干扰，见图2。
　　2.2.5 线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液4、8、10、16、20 μL，按上述色谱条件，测定峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程为：人参皂苷Rg1：A=285789.9m+9904.24，r=0.999 6； 人参皂苷Re： A=239735.86m+19055.7，
　　r=0.999 5；人参皂苷Rb1：A=203251. 68m+11271.2，r=0.999 8。结果表明， 人参皂苷Rg1在2.384～11.92 μg范围内， 人参皂苷Re在1.808～9.04 μg范围内， 人参皂苷Rb1在2.192～10.96 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
　　HPLC chromatograms of reference substances of ginsenosides Rg1， Re， Rb1（A），Sample(B)， and negative control(C)2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL， 注入液相色谱仪，连续测定6次，测得峰面积，计算峰面积积分平均值得：人参皂苷Rg1为1 568 929.4，RSD为1.51%；人参皂苷Re为1 179 013.6，RSD%=1.84%；人参皂苷Rb1为1 229 651.6，RSD为1.68%。结果表明：精密度均良好，符合定量分析要求。
　　2.2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，分别在制备后0、0.5、1、2、4、6、8 h进样，测定色谱峰峰面积， 计算峰面积积分平均值得：人参皂苷Rg1为1 777 943.4，RSD为1.53%；人参皂苷Re为757 386，RSD%=1.86%；人参皂苷Rb1为1 740 510.7，RSD为1.89%。表明样品溶液在8 h内测定结果稳定。
　　2.2.8 重复性试验 分别取同一批供试品6份，按“2.2.2”项下方法制备溶液，依法测定，计算平均含量为：人参皂苷Rg1为0.6452 mg/粒，RSD为1.69%；人参皂苷Re为0.3127 mg/粒，RSD%为1.93%；人参皂苷Rg1+Re为0.9680 mg/粒，RSD为1.98%；人参皂苷Rb1为0.6451 mg/粒，RSD为1.91%。表明本方法重复性良好。
　　2.2.9 回收率试验 精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含人参皂苷Rg10.432 4 mg、人参皂苷Re 0.216 0 mg、人参皂苷Rb1 0.410 0 mg的溶液备用。
　　取本品2粒，剪开，将内容物倾出，置烧杯中，精密加入上述人参皂苷对照品溶液各3 mL，按“2.2.1”项下方法进行样品处理及测定，计算回收率，结果见表1。
　　2.2.10 样品含量测定 分别精密称取3批样品， 按“2.2.1”项下方法制备，依法进样测定，结果见表2。 表1 加样回收率试验测定结果表2 3批样品的含量测定结果
　　3 讨 论
　　3．1 通脉软胶囊按《中国药典》(2000年版一部)规定，仅测定了人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的含量。本文以《中国药典》(2005年版一部)中［人参］项下的高效液相色谱方法为基础，对通脉软胶囊中3个人参皂苷进行了含量测定， 并分别进行了方法学考察，结果表明在本文介绍的供试品制备方法和色谱条件下，同时测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1，色谱峰分离完好，所建立的方法可以作为通脉软胶囊的质量控制方法。
　　3.2 色谱柱、柱温的影响
　　比较了大连依利特不同型号的色谱柱对测定结果的影响，发现Hypersil BDS C18柱分离较好，基线基本稳定，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re能达到基线分离，而人参皂苷Rb1也能与相邻峰达到分离度的要求。最终选择大连依利特Hypersil BDS C18色谱柱。
　　在所选择的梯度洗脱程序条件下，分别试验了不同柱温对人参皂苷保留值及分离度的影响。在25 ℃条件下，由于流动相的黏度太大，造成柱压升高，基线出现漂移。45 ℃时柱温过高，Rg1、Re分离度变差不能满足定量要求；在30 ℃条件下，人参皂苷的分离度能满足定量要求，故选择30 ℃为柱温。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：105.

［2］ 赵德华，杨德智. HPLC测定田七痛经胶囊中人参皂苷Rb1、Rg1的含量［J］.中成药，2005，27(5):532-534.

［3］ 沈志滨，朱俊访，李博.HPLC法测定益气复脉口服液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量［J］.广东药学院学报，2006，22（3）：259-260.

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