【关键词】 车前草；纯化；超氧化物歧化酶
车前草又名车前、车轮菜、猪耳草等，为车前科植物车前(Plantago asiatica L)、平车前(P.depresssa Willd) ［1］的干燥全草。车前以种子和全草入药，用于治疗小便不利、水肿、暑热泄泻、痰多咳嗽、热毒痛肿等。随着现代中药化学的不断发展，从车前中分离出许多有效成分［2］：①多糖类；②黄酮及其苷类，如：木樨草素；③环烯醚萜类，如：桃叶珊瑚甙(aucubin)、京尼平甙酸(geniposidicacid)等；④苯乙酰咖啡酰糖酯类，如：连翘酯甙(acteoside)；⑤还有熊果酸、乌苏酸、生物碱、小分子的酸性物质、β-谷甾醇苷等，从而揭示了部分传统药效的作用机制，还发现了许多传统用药所没有的新的药理作用，如：镇咳祛痰、平喘、抗衰老、缓泻、抗菌等。但是对车前草中大分子成分如蛋白、多糖等的研究很少，车前草超氧化物歧化酶的分离提纯文献尚未见报道。本文探讨了从车前中分离纯化超氧化物歧化酶的方法并鉴定其种类，为植物性超氧化物歧化酶的应用提供依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
车前草购自广州程岗路农贸市场，由广州军区广州总医院邓伟杰主管药师鉴定为车前科植物车前(Plantago asiatica L)的干燥全草。
1.2 主要仪器
凝胶层析系统（LKB）（ Pharmacia Biotech）；二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；General TU-1901紫外分光光度计（日本岛津公司）；LGJ12冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；Sorvall RC-5C低温高速离心机；电子天平TP-320A（湘仪天平仪器设备有限公司）；电子天平BP210S Sartorius（德国）；垂直电泳仪（BIO-RAD）；TGL-16H台式离心机（Beckman公司）；Universal hoodⅡ凝胶成像系统（BIO-RAD）；BYQ6044-383恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；PHS-25C pH计（上海康仪仪器有限公司）。
1.3 主要试剂
超氧化物歧化酶（华灿生物制药技术公司）；超氧化物歧化酶活性测定盒（南京建成生物工程研究所）；葡聚糖凝胶（G-75）层析填料（Pharmacia公司）；CM-Sepharose Fast Flow（Pharmacia公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（德国Merck公司）；TEMED（BIO-RAD）；丙烯酰胺（上海奥伯生物科技有限公司）；N-N亚甲基双丙烯酰胺（广州化学试剂厂）；十二烷基磺酸钠（SDS）（广州威佳科技有限公司，进口分装）；过硫酸铵（APS）（宝泰克公司）；考马斯亮蓝R-250（中国医药上海化学试剂公司）；牛血清白蛋白（BSA）（中国科学院上海生物化学研究所）；小分子蛋白质分子量标准（Mark）（Takara宝生物工程有限公司）；透析袋（分子量8 000-15 000）（北京鼎国生物公司）。
2 方法
2.1 酶活力的测定
采用南京建成生物工程公司的SOD活性测定试剂盒测定样品酶活力。酶活力单位：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U），计算公式：总SOD活力（U/mL）=A对照-A样品/A对照÷50%×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数
2.2 蛋白质浓度的测定
采用Bradford法测定蛋白质浓度，最低检出量为1 μg蛋白/mL。
2.3 酶的分离纯化
2.3.1 乙醇提取液浓度的确定 取新鲜车前草用蒸馏水洗净，甩干表面水分，称取9份，每份50 g，分成3组，粉碎后分别用30%，40%，50%（φ）乙醇100 mL，4 ℃浸提4 h，4层纱布过滤后收集滤液4 000 r/min离心1 min，取上清液用量筒稀释至150 mL，测定样品中的蛋白浓度和SOD活性，总体比较采用单向方差分析，多重比较采用LSD法，结果见表1。方差齐性检验：F=0.698，P=0.534；三组数据总体差异显著（F=8.801，P=0.016）；多重比较1∶2（P=0.010），1∶3（P=0.011），2∶3（P=0.942）。故选择比活较高的40%乙醇作为提取液。
表1 不同浓度乙醇提取后比活比较（略）
Tab.1 Comparison of specific activities after extraction with ethanol at different concentrations
2.3.2 乙醇提取液体积的确定 取新鲜车前草用蒸馏水洗净，甩干表面水分，称取9份、每份50 g，粉碎后分成3组，分别用40%乙醇1∶1，1∶2，1∶3（W∶V），4 ℃浸提4 h，4层纱布过滤后收集滤液4 000 r/min离心1 min，取上清液用量筒稀释至175 mL，测定样品中的蛋白浓度和SOD活性，总体比较采用单向方差分析，多重比较采用LSD法，结果见表2。方差齐性检验：F=1.371，P=0.323；三组数据总体差异显著（F=7.2，P=0.025）；多重比较1：2（P=0.335），1∶3（P=0.039），2∶3（P=0.010）。故选择比活较高的40%乙醇，1∶1为提取工艺。
表2 不同体积40%乙醇提取后比活比较（略）
Tab.2 Comparison of specific activities after extraction with ethanol of different volumes
2.3.3 所用丙酮体积的确定 将2.3.2中第一组的3份样品合并，再平分成9份，每份58 mL，分别按照1∶1，1∶2，1∶3（体积比）的比例加入丙酮沉淀（4 ℃，2 h），而后离心收集沉淀用5 mL蒸馏水溶解（4 ℃，1 h），最后离心取上清液用容量瓶定容至10 mL，测定样品中的蛋白浓度和SOD活性，总体比较采用单向方差分析，多重比较采用LSD法，结果见表3。方差齐性：F=1.052，P=0.406；三组数据总体差异显著（F=246.45，P=0.000）；多重比较1∶2（P=0.008），1∶3（P=0.000），2∶3（P=0.013）。故选择比活较高的1∶1（体积比）丙酮作为提取工艺。
表3 不同体积丙酮沉淀后比活比较（略）
Tab.3 Comparison of specific activities after acetone precipitation with different volumes
2.3.4 粗酶液的制备 取新鲜的车前全草，用蒸馏水洗净后甩干表面附着的水分，称重200 g，用剪刀剪碎后置高速中药粉碎机中打成浆，移至大烧杯中按1∶1(体积比)加入40%乙醇液，4 ℃浸提4 h，用10 000 g高速冷冻离心机离心15 min，收集上清液。按1∶1(体积比)缓慢加入预冷的丙酮，边加边搅拌，在4 ℃静至2 h，3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集沉淀。加2 mL蒸馏水4 ℃静至1 h溶解沉淀，3 000 r/min离心2 min，得上清液，用容量瓶定容至5 mL，即为粗酶液。
2.3.5 CM-Sepharose Fast Flow柱层析 装柱（10 mm×200 mm）后用pH4.6，0.02 mol/L的醋酸盐缓冲液平衡5个床体积。每次上样量0.4 mL，流速36 mL/h，紫外监测波长280 nm。先用平衡液洗去杂质，换用pH4.6，0.2 mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱，半小时后换用pH4.6，0.2 mol/L（含0.5 mol/L氯化钠）的醋酸盐缓冲液洗脱，收集并测定洗脱峰的蛋白浓度和SOD活力，保留活力较高的峰，透析脱盐后冷冻干燥浓缩。
2.3.6 Sephadex G-75凝胶过滤 装柱（10 mm×200 mm）后用蒸馏水平衡5个床体积。经CM-Sepharose Fast Flow柱层析并透析浓缩过的SOD蛋白质用2 mL蒸馏水溶解后上柱，每次上样1 mL，流速36 mL/h，紫外监测波长280 nm。收集并测定洗脱峰的蛋白浓度和SOD活力，保留活力较高的峰，冷冻干燥浓缩得到纯化的SOD酶蛋白。 转贴于 2.3.7 亚基分子量的测定 采用SDS-PAGE，分离胶浓度为15％。
2.3.8 酶种类的鉴定 采用抑制敏感性实验，Cu、Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感；Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不敏感，而Fe-SOD对氰化物不敏感，对过氧化氢敏感［3］。
3 结果
3.1 粗酶液的纯化
粗酶液过CM-Sepharose Fast Flow柱分离纯化，结果如图1所示，收集峰4和峰5，合并后透析、冷冻干燥浓缩后进行G-75凝胶柱纯化，结果如图2所示。收集峰1，冷冻干燥浓缩后进行SDS-PAGE，结果如图3，从图3可以看出经过两步纯化得到亚基分子量20.1 KDa的电泳纯SOD样品。
图1 车前草提取液的CM-Sepharose Fast Flow柱层析（略）
Fig.1 Column chromatogram of superoxide dismutase in plantain on CM-Sepharose Fast Flow
图2 经CM-Sepharose Fast Flow柱分离的SOD的G-75凝胶过滤图形（略）
Fig.2 Gel filtration patterns through CM-Sepharose Fast Flow column of SOD separated by G-75 column chromatography
1.车前草提取液;2.丙酮沉淀的粗酶;3.经CM-Sepharose Fast Flow柱分离的峰4和峰5;4.峰4和峰5冷冻干燥后;5.过Sephadex G-75的峰1;6.过Sephadex G-75的峰2;7.MARK（从上至下分子量依次为97.2，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 KDa）
图3 车前草SOD纯化前后的SDS-PAGE图谱（略）
Fig.3 SDS-PAGE pattern of crude SOD purified SOD from plantain
光谱带宽：2 nm；采样间隔：0.50 nm；峰1为295 nm
图4 车前草SOD的紫外吸收光谱（略）
Fig.4 The ultraviolet absorption spectra of plantain
3.2 酶种类的鉴定
取Sephadex G-75的峰1 200 μL分别与200 μL蒸馏水，2 mmol/L NaCN，10 mmol/L h3O2混匀后4 ℃放置20 min，测定SOD活力，结果5 mmol/L h3O2使经过G-75凝胶过滤的SOD活性完全失活，而1 mmol/L NaCN对其活性无影响，这表明车前草中SOD为Fe-SOD。
3.3 紫外吸收性质
通过Sephadex G-75收集到的峰1经SDS-PAGE显示为单一条带，亚基分子量20.1 KDa，对h302 敏感，氰化物不敏感，冷冻干燥后呈黄褐色粉末，以上特性与文献报道［4］的Fe-SOD一致。
4 讨论
SOD活性测定试剂盒中所有试剂的配制均应在前一天进行，以使其充分溶解。测试前从冷藏箱拿出的试剂及样品要在室温放置30 min后再用。试剂盒中的试剂一和试剂四是关键成分，为了减少取样误差，可以把两者先按比例10∶1混合再加到测试管中。空白对照管中的蒸馏水最好要新鲜配制，如放置时间过久等原因引起污染，均会造成对照管吸光度偏高，从而导致样品SOD活力增高。
实验中用到离子交换和凝胶过滤是比较传统的方法，目前运用较多的金属离子亲和层析有吸附容量大、成本低、易于再生等特点，但缺陷在于容易发生非特异性地吸附，尤其是洗脱过程中金属离子容易脱落混入蛋白成分中，影响产品质量。利用酶-底物、酶-抑制剂等生物作用原理制成生物性亲和层析，其选择性远远高于金属离子亲和层析。因此通过酶－抑制剂的亲和层析方法制备高比活的车前草超氧化物歧化酶是今后研究的一个主要方向。
通常SOD有很强的组织特异性，而且各种生物的不同发育阶段SOD的含量和种类也极不相同，豆芽中SOD含量明显高于其种子，辣椒的二叶期SOD含量最高［5］。应该对车前草不同的生长期，以及不同组织进行超氧化物歧化酶分离纯化并进行比活的比较，以获得最佳的提取材料。
通过Sephadex G-75收集到的峰2 SOD活力弱于峰1，冷冻干燥后也呈黄褐色粉末，但亚基分子量与文献不符，是否为峰1的同工酶还需做SOD活性染色及抑制性试验等进一步确定。
参考文献
［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:化学工业出版社，2005:46.
［2］李敏，程敏. 中药车前草化学成分与药理研究的新进展［J］.现代中医药，2005，3（3）:60-61.
［3］川春美，钟秋平. 超氧化物歧化酶的现状研究进展［J］.中国热带医学，2005，5(8):1731.
［4］李素霞，夏文超，袁勤生. 铁超氧化物歧化酶的研究进展［J］.中国生化药物杂志，2002，23(6):318.
［5］刘美珍. 超氧化物歧化酶［J］.海峡药学，1998，10(1):74.转贴于