作者：蔡荣钦，沈娟，林克波，邵红伟，黄树林
【摘要】 目的 研究B7.2基因在肿瘤免疫方面作用，从人外周血单核细胞中克隆人B7.2基因的全长基因，并构建含此基因的重组质粒。方法 根据人B7.2基因序列设计特异引物，用RT-PCR、巢式PCR方法扩增B7.2基因的全长基因，并构建至PGEM-T载体中，测序鉴定后进行序列分析。结果 成功构建B7.2/PGEM-T重组载体，并发现一种新的B7.2异常的剪接体，保留第1，2，3，5外显子，第四外显子全部缺失，共144 bp，其编码蛋白质由此缺少一段跨膜结构。结论 新剪接体在灵长类动物中的存在可能是个普遍现象，其对细胞功能有待进一步的研究，为研究B7. 2编码蛋白质的结构和生物学功能及其在肿瘤中的作用奠定基础。
【关键词】 B7.2；巢式PCR；基因克隆；剪接体
Abstract:Objective B7 family members include B7.1 and B7.2，which are important costimulatory molecules in immune system. So we clone the full-length CDS of human B7.2 gene from PBMC (peripheral blood mononuclear cell). Methods lt was designed that specific primers of human B7.2 gene and gained its full-length CDS by RT-PCR and nested PCR，then ligated the objective fragment into pGEM-T vector and transformed into E. coli for screening. The positive clones which were identified by Colony PCR were taken for sequence analysis. Results lt was constructed that the B7.2/ pGEM-T recombinant plasmid successfully and discovered a new B7.2 splice variant. This variant keeps its exon 1，2，3，5，but its exon 4 is absent. This lost exon takes 144 bp，which leads to an absence of a trans-membrane region in the integrated B7.2 protein.Conclusion The clone of human B7.2 gene lays solid base for the investigation of the structure and function of B7.2 protein and its biological effect in tumor immunology. However，the potential impact of this new splice variant sill needs further investigation.
Key words:B7.2; nested PCR; gene cloning; splice variant
激活T淋巴细胞、T细胞的完成活化有赖于双信号和细胞因子的作用［1］，首先APC将肽－MHC复合物提呈给T细胞，TCR特异性识别结合在MHC分子槽中的抗原肽，启动抗原识别信号（即第一信号）；同时还需要APC提呈第二信号，即APC上的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体相互作用——B7：CD28／CTLA4共刺激信号［2］。T细胞在缺乏共刺激信号的情况下，抗原识别介导的第一信号非但不能有效激活特异性T细胞，反而会导致T细胞无能。
B7家族分子主要包括B7.1和B7.2，表达于单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞等，是2个提供协同刺激信号的重要分子［1］。Martin-Fontech等［3］报道，B7.2在诱导排斥非免疫系肿瘤方面优于B7.1，并且在排斥免疫性肿瘤方面同样有效。由此可见，B7.2分子在协同刺激T淋巴细胞增殖、协同细胞介导的细胞毒作用等一系列生物学效应中发挥了重要的作用［3］。人B7.2基因定位于第3号染色体(3q21)［4］，其蛋白产物氨基端有一段23个氨基酸残基构成的信号肽，蛋白酶在23～24位丙氨酸之间切断信号肽，产生由306个氨基酸残基组成的分子量为34 kD的Ⅰ型跨膜蛋白，其中220个氨基酸残基构成具有免疫球蛋白超家族( superfami1y) V和C结构域的胞外区，含有8个潜在的N-糖基化位点，23个氨基酸残基构成疏水性跨膜区和60个氨基酸构成胞浆内区［5］。
本研究通过从人外周血单核细胞中克隆人B7.2编码区全长基因，得到一个新的差异剪接体，为进一步研究B7.2所编码的蛋白质结构和生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料
人新鲜血液由广州市血液中心提供，大肠杆菌DH5α均由本实验室保存，M-MLV反转录试剂盒，pGEM-T试剂盒购自Promega公司，Taq plus酶、 Trizol购自Fermentas公司，人淋巴细胞分离液为TD science产品，凝胶纯化试剂盒为V-gene公司产品，上、下游引物由Invitrogen公司合成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计
根据GeneBank人B7.2 cDNA序列设计引物。外上引物B72t1：5′-TATTAGGTCACAGCAGAAGC-3′；外下引物B72t2：5′-GAATACTTGTATGGGCTTAC-3′；内上引物B72e1：5′-GCCTCTAGAGCCACCAATGG ATCCCCAGTGCACTAT-3′；其中斜体表示XbaI酶切位点，划线部分序列为Kozak序列；内下引物B72e2：5′-TTAGGTACCTTAAAA ACATGTATCACTTTTGT-3′，其中斜体表示KpnI酶切位点（扩增长度为972 bp）。引物合成由上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen）完成。
1.2.2 总RNA提取 先用淋巴细胞分离液按说明从人外周血中分离淋巴细胞，细胞计数后，在1.5 mL DEPC处理后EP管中加入1 mL Trizol液，从1×107个淋巴细胞中提取总RNA。120 V电压0.8%的琼脂糖电泳鉴定。在260/280 nm下测定RNA的纯度和含量。RNA置-70 ℃ 下备用。
1.2.3 反转录成cDNA 取1 μg 淋巴细胞的RNA进行反转录，方法参照产品说明书。
1.2.4 巢式PCR扩增人B7.2基因全长cDNA 扩增体系：模板1 μL、5 μmol/L引物各2 μL、1UTaq酶、buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、用ddh30补足至25 μL。循环参数：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。得到第一次PCR产物后，再以B72 e1、B72 e2为引物，第一次PCR产物分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍、1 000倍为模板进行第二轮扩增［6］，反应体系及循环参数同上。
1.2.5 克隆载体pGEM-B7.2的构建 扩增产物经胶回收纯化后，与pGEM-T载体按推荐体系，4 ℃连接16 h，连接产物转化感受态DH5α菌，铺于含IPTG/X-Gal/Amp的LB平板上，蓝白斑筛选阳性克隆，再以菌落PCR鉴定后进行测序。测序工作由Invitrogen公司完成，所得序列与GenBank中的B7.2基因进行对比。
1.2.6 蛋白质二级结构分析 为了解核酸序列变化对蛋白质二级结构的影响，进行相关分析。分析网址：http://www.predictprotein.org/newwebsite/submit.php 。在“Paste or type your sequence”中输入蛋白质序列，点击“SUBMIT”进行分析。
2 结果
2.1 RT-PCR
总RNA含量为1.5 g/mL，A260/280为1.821，纯度符合RT-PCR 要求。将B7.2 RT-PCR产物取样在1%琼脂糖凝胶上电泳检验，在1 000 bp 处有一明显条带，与预期目的带大小一致。
M:100 bp DNA Ladder; 1:PCR product
图1 B7.2 巢式PCR第一轮产物的电泳图谱（略）
Fig.1 The electrophoresis of first round product
将第一次产物以不同倍数稀释，用作模板进行第二次PCR扩增。
M:100 bp Ladder marker; 1:PCR products(template 1∶30); 2:PCR products(template 1∶10); 3:PCR products(template 1∶50); 4:PCR products(template 1∶100); 5:PCR products(template 1∶1 000)
图2 B7.2 巢式PCR第二轮产物的电泳图谱（略）
Fig. 2 The electrophoresis of second round product
lane1（稀释50倍）的条带最亮，大小在1 000 bp左右，割胶回收纯化后，与PGEM-T连接，转化DH5α。
2.2 TA克隆菌落PCR鉴定及序列测定
从转化平板上随机挑取数个菌落进行PCR鉴定（见图3），菌落PCR结果大多均在1 000 bp左右，但有些菌落PCR产物略小，将经鉴定后的阳性菌落送交测序。
M：DNA标准；1～6：colony PCR product
图3 菌落PCR产物的电泳图（略）
Fig.3 Electrophoresis of colony PCR product
大多产物与基因库中B7.2的序列相似性均达100％，但略小的产物出现了不同的RNA剪接方式，即：第四个外显子完全缺失，共144个碱基。通过与其他物种B7.2基因序列比较，发现该剪接体第四外显子缺失的现象在狒狒（Papio cynocephalus），犬类(Canis familiaris)，野猪（Sus scrofa），羊（Ovis aries）中均有存在。
验证第四外显子缺失对蛋白质二级结构的影响，在http://www.predictprotein.org/newwebsite/submit.php，对正常B7.2的蛋白质序列及新剪接体产物蛋白序列进行相关预测，见图5、6所示。
由分析可见，新剪接体缺失第四外显子造成蛋白质水平改变即缺失一段跨膜结构域。
Homo：人；Pan：黑猩猩；new:人新剪接体；Papio:狒狒；Sus:野猪；Ovis:羊；Canis:犬
图4 B7序列对比结果（略）
Fig.4 The B7 sequence blast result
图5 正常序列蛋白质二级结构分析（略）
Fig.5 The secondary structure analysis of natural B7.2 protein
图6 新剪接体蛋白质二级结构分析（略）
Fig.6 The protein secondary structure analysis of the new splice variant
3 讨论
本实验结果表明，被测人体内有2种B7.2剪接体，其中存在一个在703～846 bp之间缺少144个bp差异剪接体，经蛋白质二级结构分析，由于该外显子的缺失，导致了疏水跨膜区的缺失，但信号肽，胞外免疫球蛋白结构域及胞内区保存完整，则该蛋白产物可能为一种分泌型产物，可以维持结合原配体功能，与膜型B7共同调节人体免疫。该第四外显子缺失的现象在狒狒（Papio cynocephalus），犬类(Canis familiaris)，野猪（Sus scrofa），羊（Ovis aries）等物种中均有存在，这些物种均存在膜型和非膜型两种B7分子剪接体，推测膜型和非膜型B7分子的存在于高等生物中可能是个普遍现象。研究发现的B7.2这个截短的蛋白质究竟对人体免疫功能产生什么具体影响，以及它产生的作用机制背景还有待于进一步研究探索验证。
基因治疗是继手术、放疗、化疗之后的第4种肿瘤治疗方案，共刺激分子B7属于免疫球蛋白超家族成员，存在于抗原提呈细胞表面，在免疫应答过程中发挥重要作用，在肿瘤免疫基因治疗中的作用成为目前肿瘤研究的热点之一。目前，B7转基因治疗恶性肿瘤的研究已取得巨大的进展。美国NIH已批准“利用B7基因转染的肿瘤细胞可制备新型瘤苗［7］”将其试用于临床。从动物试验过渡到人类临床试验，其疗效有待进一步观察。制备B7抗体融合蛋白以及制备抗B7抗体免疫毒素等，与细胞因子、趋化因子等的联合使用［8，9］也将成为肿瘤免疫治疗的一亮点。也许不久的将来，B7基因疗法可望成为临床肿瘤治疗的辅助手段。而人们对B7分子作用机理的研究仍有待于进一步了完善。相信随着研究的不断深入，B7分子将成为人类征服肿瘤的一种新的有力武器。
【
参考文献
】［1］陈慰峰，金伯泉.医学免疫学［M］.4版.北京：人民卫生教育出版社，2005:148-149.
［2］FREEMAN G J，GRIBBEN J G，BOUSSIOTIS V A，et al. Cloning of B7.2:CTLA-4 counter-receptor that costimulate human T cell proliferation［J］. Science，1993，262:909-911.
［3］MARTIN-FONTECHA A，CAVALLO F，BELLONE M，et al. Heterogeneous effects of B7.1 and B7.2 in the induction of both protective and therapeutic antitumor immunity against different mouse tumors［J］. Eur J Immunol，1996，26:1851-1859.
［4］JUNG D，HILMES C，KNUTH A，et al. Gene transfer of the costimulatory molecules B7.1 and B7.2 enhances the immunogenicity of human renal cell carcinoma to a different extent［J］.Scand J Immunol，1999，50(3):242-249.
［5］张智博，王爱民，肖波，等.急性脑血管病患者协同刺激分子表达的研究［J］.中华神经科杂志，2001，34(4):237-241.
［6］SANDY P，RICHARD T，BOB O.基因操作原理［M］.6版.北京：高等教育出版社，2003:223-225.
［7］曹艳红，刘旭.肿瘤的共刺激分子B7基因疗法研究进展［J］.实用肿瘤学杂志，2002，16(1):65-67.
［8］胡锦跃，朱建高，李官成，等.趋化因子MCP-3基因和B7基因共转染诱导抗大肠癌主动免疫［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2002，9(2):77-81.
［9］王振发.趋化因子和B7分子联合应用抗肿瘤的研究进展［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2007，14(1):94-96.