尚菲 曾德意 杨慧 黄琳燕 刘捷 吕晓飞 关永源 周家国
【摘要】 【目的】 探讨microRNA-155(miR-155)对巨噬细胞泡沫化过程的影响及机制?【方法】 实时定量PCR检测miR-155的表达，Western Blot方法检测巨噬细胞A类清道夫受体SR-A和B型清道夫受体CD36的表达，激光共聚焦显微镜观察miR-155对THP-1结合?摄取DiI标记氧化型低密度脂蛋白(DiI-oxLDL)能力的影响?【结果】 80 μg/mL的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)时间依赖性地诱导巨噬细胞miR-155表达上调?过表达miR-155抑制SR-A和CD36的表达，同时巨噬细胞结合?摄取DiI-oxLDL的能力明显降低?而反义-miR-155则明显上调SR-A和CD36的表达，同时巨噬细胞结合?摄取DiI-oxLDL的能力明显增强?【结论】 MiR-155通过降低巨噬细胞SR-A和CD36的表达抑制巨噬泡沫细胞的形成?
【关键词】 miR-155; 动脉粥样硬化; THP-1巨噬细胞; 清道夫受体; 泡沫化
Abstract: 【Objective】 To study the effect of microRNA-155 (miR-155) on macrophagic foam cell formation. 【Methods】 Real-time RT-PCR was used to test the expression of microRNA-155. Western blot was used to determine the expression of scavenger receptors SR-A and CD36 in THP-1 macrophages. Receptor-specific binding and uptake of DiI-labeled ox-LDL (DiI-oxLDL) were examined by laser scanning confocal microscope. 【Results】 In THP-1 cells， 80 μg/mL oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) induced up-regulation of miR-155 in a time-dependent manner. Ad-miR-155 transfection decreased the expression of SR-A and D36， and the uptake and binding of THP-1 cell with DiI-oxLDL. In contrast， miR-155 inhibitor increased the expression of SR-A and CD36， and the uptake and binding of THP-1 cell with DiI-oxLDL..【Conclusion】 MicroRNA-155 inhibits macrophagic foam cell formation through decreasing the expression of SR-A and CD36.
Key words: microRNA-155; atherosclerosis; THP-1 cell; foam cell; Scavenger receptor
表1〓AuNP和EPI-AnNP的流体粒径(nm)和Zeta电位
表阿霉素(epirubicin，EPI)为第二代蒽醌类抗肿瘤抗生素，在肿瘤的治疗中占有重要地位，但是由于靶向性差限制了其进一步临床应用[1]，如何提高EPI的靶向性已成为目前急需解决的问题?近年来，纳米生物医学的发展为其提供了新的解决思路:将EPI组装于纳米载体上，组成纳米载药系统，该系统既可以提高EPI靶向性，又可以延长其体内滞留时间，从而提高药物疗效[2]?纳米金(gold nanoparticles，AuNP)是直径介于1 ~ 100 nm的金颗粒，具有生物相容性好?组织渗透性强?表面易于修饰等优点[3]?有研究表明:AuNP本身具有抗肿瘤血管生成作用，其主要机制为:AuNP可以结合血管内皮生长因子(VEGF165)的肝素结合位点，阻断其激活受体VEGFR2，进而抑制肿瘤血管内皮细胞的活化增殖[4-5]?另外，AuNP可以通过物理吸附?离子键结合?共价结合等方式结合抗肿瘤药物，组成AuNP载药系统[6]?该系统理论上既可以抗肿瘤血管生成，又可以抗肿瘤本身，发挥多靶点抗肿瘤作用?本实验中，课题组成功合成纳米金-表阿霉素载药系统(epirubicin-nanogold compounds， EPI-AuNP)，体外观察其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVEC)?人肝癌细胞(HepG2)的增殖抑制作用，为将其进一步应用于体内多靶点抗肿瘤作用提供实验依据?
1 材料与方法
1.1 材 料
表阿霉素(EPI)为美国Sigma公司产品，纳米金(AuNP)自行制备:合成原料氯金酸?柠檬酸钠均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司?RPMI-1640培养液?L-谷氨酰胺?青霉素及链霉素均购于美国Hyclone公司;M199培养液?胎牛血清?胰蛋白酶为Gibco公司产品，MTT (四甲基偶氮唑盐)及DMSO(二甲基亚砜)为美国Sigma公司产品，实验用水为超纯水?人肝癌细胞株HepG2由本科室保存，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为原代分离培养?动态激光散射仪(BI9000AT)为美国Brookhaven公司产品;紫外-可见分光光度计(Lambda 45)为美国PerkinElmer公司产品;透射电子显微镜(TECNAI 10)为Philips公司产品;全波长多功能酶标仪(safire Ⅱ)为美国Bio-Rad公司产品;相关酶标板为Costar酶标板?
1.2 AuNP的合成及鉴定
我们采用氯金酸还原法，即利用柠檬酸将氯金酸中的Au+3还原为Au0?合成所用器皿均经过王水处理，5 mL柠檬酸钠(38.8 mmol/L)加入煮沸的50 mL氯金酸(1 mmol/L)溶液中，用力搅拌过夜，溶液变为葡萄酒色，AuNP即合成?冷却至室温，用0.22 μm滤器过滤，于4 ℃在玻璃瓶中保存备用;利用透射电子显微镜(TEM)和紫外-可见分光光度计(UV-Vis)对其进行鉴定?
1.3 EPI-AuNP复合体的合成
取合成后的AuNP溶液4 mL，用超纯水稀释至8 mL，用1 mol/L NaOH溶液调pH为8.0(根据预实验结果)，然后加入一定浓度的EPI溶液2 mL?置于恒温空气摇床(120 r/min) 37 ℃过夜?然后20 000 r/min(r = 6.4)离心40 min，弃去上清液，用0.01mol/L PB液冲洗3次?重复离心?冲洗3次后将制备的EPI-AuNP重悬于0.01 mol/L PB液中备用?
1.4 EPI-AuNP复合体的鉴定
取相同浓度AuNP?EPI-AuNP溶液:①动态激光散射仪(DLS)对其粒径变化进行检测;②Zeta电位仪检测其Zeta电位变化;③紫外-可见分光光度计(UV-Vis)对其吸收光谱进行检测?另外，利用全波长多功能酶标仪(safire Ⅱ) (激发波长500 nm，发射波长560 nm)对相同浓度EPI?EPI-AuNP溶液的荧光强度进行检测?
1.5 EPI-AuNP复合体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的影响
1.5.1〓HUVEC的分离培养〓取本医院产科健康产妇足月顺产或剖宫产的脐带，长度&>20 cm，无菌条件下用PBS缓冲液洗净血迹，将脐静脉两端夹闭后管腔内注入2.5 g/L胰酶进行消化，10 min后收集脐静脉消化液，1 000 r/min(r = 16.1 cm)离心10 min，轻轻弃去上清液，将HUVEC重悬于完全培养基(M199+100 mL/L胎牛血清)，37 ℃?体积分数5% CO2培养箱培养?根据细胞生长情况，2 ~ 3 d换液1次?传代至第3代时进行以下实验?
1.5.2〓MTT比色法检测各组HUVEC的生存率〓实验分为AuNP处理组?EPI处理组?EPI-AuNP处理组和空白对照组，每组设6个复孔?HUVEC以5×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后各组分别加入1 μg/L AuNP?2 mg/L EPI?含2 mg/L EPI的EPI-AuNP溶液和无血清培养液200 μL，继续培养24 h?实验终止前4 h，每孔加入0.5% MTT溶液20 μL?4 h后弃去上清液，加入DMSO 150 μL/孔?用多功能酶标仪(测量波长570 nm，参比波长630 nm)测吸光度(A)值，细胞生存率(%) =(实验组A值/对照组A值)×100%，以上实验重复3次?
1.5.3〓紫外-可见分光光度计(UV-Vis)检测HUVEC内EPI的积聚量〓实验组分为EPI处理组和EPI-AuNP处理组，每组设6个复孔?将HUVEC以1×105个/孔种于6孔板?培养24 h后各组分别加入EPI溶液 (10 mg/L)和EPI-AuNP溶液(含相同浓度EPI) 1 mL?继续培养2 h后将细胞用胰酶消化，移入1.5 mL EP管中，离心(2 000 r/min，r = 15.9 min)，0.1 mol/L PBS洗3次后弃上清，1% Triton X-100(100 μL)裂解细胞，UV-Vis测其480nm处吸光度(A)，根据EPI浓度-吸光度标准曲线得出各组HUVEC细胞内的EPI积聚量?
1.6 EPI-AuNP复合体对HepG2细胞的影响
1.6.1〓HepG2细胞的培养〓使用含100 mL/L胎牛血清?青霉素1×105U/L?链霉素100 mg/L的RPMI-1640培养HepG2细胞，2 d更换培养液1次?待HepG2细胞铺满培养瓶底的80% ~ 90%后，进行传代培养?
1.6.2 MTT比色法检测各组HepG2细胞的生存率〓实验分为AuNP处理组?EPI处理组?EPI-AuNP处理组和空白对照组，每组设6个复孔?HepG2细胞以5×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后分别加入10 μg/L AuNP溶液?20 mg/L EPI溶液?含20 mg/L EPI的EPI-AuNP溶液和无血清培养液200 μL，继续培养24 h?MTT比色法检测各组HepG2细胞的生存率?
1.6.3〓UV-Vis检测HepG2细胞内EPI的积聚量〓实验组分为EPI处理组和EPI- AuNP处理组，每组设6个复孔?将HepG2细胞以1×105个/孔种于6孔板?培养24 h后各组分别加入EPI溶液 (20 mg/L)和EPI-AuNP溶液(含相同浓度EPI) 1 mL?继续培养2 h后用胰酶消化细胞，移入1.5 mL EP管中，离心(2 000 r/min，r = 15.9 cm 5 min)，0.1 mol/L PBS洗3次后弃上清，1% Triton X-100(100 μL)裂解细胞，UV-Vis检测各组HepG2细胞内EPI的积聚量?
1.7 统计学分析
采用SPSS 13.0软件进行分析:统计资料用x ± s表示，对应组间比较用完全随机设计资料的方差分析检验;两组之间比较采用两独立样本t检验?P &< 0.05表示差异有统计学意义?
2 结 果
2.1 AuNP的合成及鉴定
通过透射电子显微镜(TEM)观察到(图1A):AuNP颗粒呈球形，大小均匀，直径在15 nm左右，离散度好;紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)显示AuNP的最大吸收峰在520 nm处(图1B)?
2.2 EPI-AuNP复合体的合成及鉴定
2.2.1〓紫外-可见吸收光谱〓AuNP的最大吸收峰在520 nm处，而EPI-AuNP的最大吸收峰在525 nm处，该最大吸收峰的红移(5 nm)是由于EPI吸附于AuNP表面改变了AuNP的介电常数，间接表明AuNP与EPI发生有效结合(图 2)?
2.2.2〓荧光淬灭实验结果 该实验是检验EPI和AuNP能否有效结合的重要手段，因为AuNP可以对EPI发出的荧光进行有效淬灭?EPI (100 mg/L)经500 nm波长激发后可以在560 nm波长处发出荧光，其荧光强度为195.2 ± 7.5，而结合的AuNP可以通过与EPI的电子之间相互作用对其荧光产生淬灭效应:EPI-AuNP的荧光强度为16.4 ± 5.0，t=62.619，P=0.000，差异有统计学意义 (图 3)?
2.2.3〓动态激光散射仪(DLS)检测AuNP和EPI-AuNP的粒径〓AuNP的平均粒径为(14.34 ± 0.75)nm，EPI-AuNP的平均粒径为(18.54 ± 1.84)nm，t=-4.722，P=0.005，差异有统计学意义(表 1)?
2.2.4〓Zeta电位仪检测结果〓AuNP的Zeta电位为(-21.19 ± 0.64)mV;EPI-AuNP的Zeta电位为(-15.34 ± 0.72)mV，t=-13.543，P=0.000，差异有统计学意义?
2.3〓AuNP?EPI和EPI-AuNP复合体对HUVEC的影响
2.3.1〓MTT结果〓如图 4所示:与对照组比较，AuNP(1 μg/L)溶液对HUVEC的生存率几无影响(t=-0.180，P=0.861);EPI(2 mg/L)处理组HUVEC 的生存率为(29.25 ± 1.59)%，t=46.992，P=0.000;EPI-AuNP处理组HUVEC 的生存率为(21.29 ± 1.51)%，与对照组以及EPI处理组相比，其对HUVEC生存率的影响均具有统计学意义(t=52.773，P=0.000;t=8.868，P=0.000)?
2.3.2〓UV-Vis结果〓图 5显示了各药物处理组HUVEC细胞内EPI的积聚量，EPI处理组:(1.19±0.17)g;EPI-AuNP处理组:(2.61±0.55)g，t=-6.101，P=0.000，差异有统计学意义?
2.4 EPI-AuNP复合体对HepG2细胞的影响
2.4.1〓MTT结果〓如图 6所示:与对照组相比较，AuNP(10 μg/L)溶液对HepG2细胞的生存率没有影响(t=1.401，P=0.192)?EPI(20 mg/L)处理组HepG2细胞的生存率为(71.10 ± 4.16)%，t=14.195，P=0.000?EPI-AuNP处理组HepG2细胞的生存率为(43.82 ± 2.21)%，明显低于对照组和EPI处理组(t=38.962，P=0.000;t=14.203，P=0.000)?
2.4.2〓UV-Vis结果〓图 7显示了各组HepG2细胞内EPI的积聚量，EPI处理组:(1.72 ± 0.13)μg;EPI-AuNP处理组:(3.65 ± 0.20)μg，t=-19.976，P=0.000，差异有统计学意义?
3 讨 论
本课题组成功合成了纳米金-表阿霉素载药系统(EPI-AuNP):①紫外-可见吸收光谱(图 2)显示EPI-AuNP较AuNP最大吸收峰发生红移(5 nm)，该最大吸收峰的红移是由于EPI的吸附改变了AuNP表面的介电常数，表明AuNP与EPI发生有效结合[7]?②荧光淬灭实验是检验EPI和AuNP能否有效结合的重要手段，因为AuNP可以对EPI发出的荧光进行有效淬灭?EPI (100 mg/L)经500 nm波长激发后在560 nm波长处发出荧光，其荧光强度为195.2 ± 7.5，而结合的AuNP可以通过与EPI的电子之间相互作用对其荧光产生淬灭效应[8]:EPI-AuNP的荧光强度为16.4 ± 5.0，P &< 0.01 (图 3)，该实验证实了EPI与AuNP的成功结合，并且其结合的方式包含静电作用;③通过动态激光散射仪(DLS)检测AuNP和EPI-AuNP的粒径(表 1)，结果如下:AuNP的平均粒径为(14.34 ± 0.75)nm，EPI-AuNP的平均粒径为(18.54 ± 1.84)nm，P&<0.01?该粒径的变化可以从两方面来理解:① EPI在AuNP表面的吸附使其粒径增加;② EPI分子中的氨基?酚羟基等基团可以吸附溶液中的抗平衡离子，形成双电子层，增加EPI-AuNP的粒径[9]?(4) Zeta电位仪检测结果显示:AuNP的Zeta电位为(-21.19 ± 0.64)mV，这是因为:AuNP合成过程中的还原剂柠檬酸根环绕在AuNP表面，防止其相互聚集，成为AuNP的稳定剂?柠檬酸根自身含3个羧基(pKa1=3.13，pKa2 =4.76，pKa3=6.40)，在pH=8.0的环境中去质子化而带负电荷?EPI-AuNP的Zeta电位为(-15.34 ± 0.72)mV，其Zeta电位绝对值较AuNP减小，表明EPI成功结合在AuNP表面?
EPI-AuNP对HUVEC及HepG2细胞均有明显的增殖抑制作用?EPI处理组HUVEC?HepG2细胞的生存率分别为(29.25 ± 1.59)%?(71.10 ± 4.16)%;EPI-AuNP处理组HUVEC?HepG2细胞的生存率为(21.29 ± 1.51)%?(43.82 ± 2.21)%，其较EPI对HUVEC及HepG2细胞生存率的影响均具有统计学意义(P &< 0.01)?图 5?7分别显示了EPI?EPI-AuNP处理组HUVEC和HepG2细胞内EPI的积聚量，EPI处理组:(1.19 ± 0.17)μg?(1.72 ± 0.13)μg;EPI-AuNP处理组:(2.61 ± 0.55)μg?(3.65 ± 0.20)μg?P &< 0.01?这是由于AuNP可以与HUVEC?HepG2细胞膜蛋白相互作用，促进细胞对EPI-AuNP的内吞作用，增加EPI在细胞内的积聚量;同时避免EPI在细胞内快速降解，延长药物半衰期，提高其抗肿瘤效果[10-12]?
本实验成功合成了EPI-AuNP，并对其体外抗肿瘤作用进行了初步观察，结果证实该纳米载药系统对HUVEC?HepG2细胞均具有增殖抑制作用，且该抑制作用强于EPI，其主要机制为:EPI- AuNP复合体可以增加HUVEC?HepG2细胞对EPI的内吞作用，同时避免其在细胞内快速降解，延长细胞内药物半衰期，增加细胞内EPI的有效浓度，从而发挥更强的细胞增殖抑制作用[2，6]?该体外实验证实EPI-AuNP复合体对HUVEC?HepG2细胞均具有增殖抑制作用，推测其在体内有多靶点抗肿瘤作用，其体内实验有待于进一步研究?
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