张剑 张琪 张英才 朱焕兵 汪国营 杨扬
【摘要】 【目的】 探讨白细胞分化抗原40配体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSC)对异种胰岛移植排斥反应的抑制作用?【方法】 建立Wistar-SD大鼠异种胰岛移植模型，用携带分泌型CD40LIg基因的重组腺病毒感染的MSC进行干预治疗?取糖尿病大鼠45只，随机分为3组(每组15只):对照组植入胰岛细胞;单纯MSC组植入MSC和胰岛细胞;基因转染MSC组植入CD40LIg基因转染的MSC和胰岛细胞?观察糖尿病大鼠胰岛移植后生存情况?血糖变化和移植物病理形态学改变，检测移植物CD40LIg和胰岛素的表达以及移植大鼠细胞因子水平变化?【结果】 ①糖尿病大鼠血糖平均在移植后2 d恢复正常，对照组血糖平均在移植后7 d升高，单纯MSC组和基因转染MSC组血糖分别在20 d和47 d升高?②对照组?单纯MSC组和基因转染MSC组，移植物存活时间分别为(9.5 ± 3.2)d?(25.2 ± 5.3)d和(53.6 ± 7.5) d，各组间比较具有显著差异(F=5.362，P &< 0.05);移植糖尿病大鼠生存时间分别为(24.1 ± 6.8)d?(51.7 ± 7.9)d?(95.2 ± 12.7)d，各组间比较差异具有显著性(F=6.821，P &< 0.05)?③对照组在胰岛移植后7 d内，IL-2和TNF-α的水平均急剧上升，IL-4和IL-10的水平较移植前显著下降(P &< 0.01)?④两个治疗组移植物内均可见成片的胰岛细胞团，未见淋巴细胞浸润，转染MSC组移植物内可见CD40LIg和胰岛素的表达?【结论】 CD40LIg基因修饰骨髓间充质干细胞可以延长胰岛移植物的存活时间，抑制大鼠异种胰岛移植的排斥反应?
【关键词】 骨髓间充质干细胞; CD40LIg; 胰岛移植; 糖尿病
Abstract: 【Objective】 To investigate the effects of cluster of differentiation 40 ligand immunoglobulin (CD40LIg) modified bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) on the rejection of rat islet xenografts. 【Methods】 The islet xenografts model was established with islet cells of Wistar rat transplant under the left kidney capsule of diabetic SD rat. MSC were infected with the recombinant adenoviruses containing CD40LIg gene as intervention treatment. Forty-five modeled diabetic rats were randomly pided into three groups with 15 in each: only islet cells were transplanted to rats in control group (A)， islet cells and MSC were transplanted to rats in MSC group (B) and islet cells and MSC infected with CD40LIg gene were transplanted to rats in transfected MSC group (C). The blood sugar and the survival of transplantation rats and grafts were observed after transplantation. The morphological changes of grafts were observed. Expression of CD40LIg and insulin were detected by immunohistochemical staining and cytokines were quantified by ELISA. 【Results】 (1) The blood sugar of transplantation rats decreased to normal level on day 2 after transplantation. The average level blood glucose of control group (A)， MSC group (B)， transfected MSC group(C) increased on day 7，20，47， after transplantation respectively. (2) The grafts of group A， B， and C survived for (9.5 ± 3.2)， (25.2 ± 5.3)， and(53.6 ± 7.5) days， respectively. There are significant deviation of the grafts survival among group A， B and C(F=6.821，P &< 0.05). The survival of transplantation rats were (24.1 ± 6.8)，(51.7 ± 7.9)，and(95.2 ± 12.7) days in group A， B， and C， respectively. The survival of transplantation rats compared each other were same as the survival of grafts (F=6.821，P &< 0.05).(3)In group A， Serum IL-2 and TNF-α concentration were elevated to a high level within seven days post-transplantation and significantly increased compared with that pre-transplantation(P&<0.01). Serum IL-4 and IL-10 concentration were significantly decreased compared with that pre-transplantation(P&<0.01).(4) Hematoxylin-eosin staining of grafts showed islets bolus under the kidney capsule of transplantation rats， no inflammatory cell infiltrate and expression of insulin protein at islets in group B and C. The grafts positively stained for CD40LIg in group C. 【Conclusion】 CD40LIg gene modified bone marrow mesenchymal stem cells could prolong the survival time of islet xenografts and inhibit the rejection of islet xenografts.
Key words: islet xenografts; diabetes mellitus; bone marrow mesenchymal stem cells; CD40LIg
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性心血管疾病，严重威胁人类健康?尽管动脉粥样硬化是一个多因素参与的复杂病理过程，但血液中的单核细胞迁移至内皮下分化为巨噬细胞后吞噬脂质，特别是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein， ox-LDL)，进而形成泡沫细胞仍然是关键环节?巨噬细胞吞噬脂质主要通过细胞膜上的清道受体(scavenger receptors， SRs)完成?其中，A类清道夫受体(scavenger receptor A，SR-A)和B型清道夫受体CD36(cluster of differentiation36，CD36)在巨噬细胞摄取各种修饰型低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)过程中发挥了重要作用[1]?近年来研究表明，微小RNA(microRNA) 参与调控了心血管系统的多种功能， 其表达异常与多种心血管疾病的发生和发展密切相关[2]?MicroRNA-155(miR-155)是一个典型的多功能microRNA，已有资料表明，miR-155在免疫反应?炎症?肿瘤发生等过程中发挥了重要的作用[3]?最近的研究显示miR-155在巨噬细胞泡沫化过程中表达上调[4]，但其对巨噬细胞泡沫化和动脉粥样硬化形成的作用尚不清楚?本研究探讨了miR-155对THP-1巨噬细胞泡沫化过程的影响及其可能机制，以评估miR-155是否可作为防治动脉粥样硬化的新靶点?
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
人类单核细胞株THP-1细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所);RPMI1640 细胞培养基?胎牛血清?青/链双抗(GIBCOBRL公司);佛波酯(PMA)?油红O?Hoechst33258?蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma公司);SR-A和CD36抗体(R&&D公司);HRP标记的驴抗山羊IgG(Santa Cruz公司);l，l’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate(DiI)荧光探针(Probe公司);其余试剂均为进口或国产分析纯产品?
CO2培养箱(美国Precision公司);SW-CJ-IF超净工作台(江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);pH计(瑞士Mettler Toledo公司);倒置显微镜(重庆光学仪器厂);激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司);超速离心机(美国Beckman公司);酶联免疫仪(美国MJ RESEARCH公司);小型垂直电泳和电转装置?荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)?
1.2 Ad-miR-155和Ad-anti-miR-155腺病毒载体构建
腺病毒载体的构建参照文献报道的方法[5]?Ad-miR-155(5′-TCGAGCCCCTATCACGATTAGCA TTAATTCAAGAGATTAATGCTAATCGTGATAGGGGA-3′)和Ad-anti-miR-155(5′-CTAGTCCCCTATC ACGATTAGCATTAATCTCTTGAATTAATGCTAATCGTGATAGGGGC-3′)的制备按照 AdMax(Microbix)和pSilencerTM adeno 1.0-CMV (Ambion) systems说明书进行?病毒经HEK293A细胞进行包装?扩增后，CsCl纯化，含100 mL/L甘油的20 mmol/L Tris缓冲液透析，于-70 ℃保存?腺病毒滴度测定按照Adeno-X Rapid Titer kit (BD Biosciences Clontech， Palo Alto， CA， USA) 试剂盒说明书进行?实验中以Ad-LacZ转染组作为对照?
1.3 Ox-LDL和DiI-oxLDL的制备
Ox-LDL的制备按文献报道的方法[6]，采用硫酸铜氧化法，简述如下:健康人血浆购自中山大学附属第一医院血液科，采用密度梯度离心的方法，制备LDL?将LDL于4℃透析24 h，期间换液3次?在37℃下用终浓度为5 μmol/L 的CuSO4氧化24 h?接着分别用含200 μmol/L EDTA和不含EDTA的PBS 4 ℃下分别透析24 h和48 h?用Bradford法测定蛋白含量?在无菌条件下采用0.45 μm滤膜过滤除菌，4 ℃避光保存，一周内用完?
DiI-oxLDL(1，1′-dioctadecyl-3，3，3′3′-tetra-methy-lindocyanide percholorate (DiI)-labeled oxLDL)的制备方法如下[7-9]，采用密度梯度离心的方法，制备LDL，用一定量的无脂蛋白血清调节LDL浓度至1 mg/mL，每毫升LDL中加入5 μL浓度为30 mg/mL的DiI储存液，37 ℃避光孵育18 h，使LDL转变为Dil-LDL?经密度梯度离心提取DiI-LDL，PBS透析48 h，期间换液3次?加入终浓度为5 μmol/L的CuSO4，37 ℃氧化24 h，然后分别用含200 μmol/L EDTA和不含EDTA的PBS分别透析24?48 h?采用0.45 μm滤膜过滤除菌，4 ℃避光保存，一周内用完?
1.4 细胞培养和实验分组
THP-1细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，用含100 mL/L小牛血清，1%双抗的RMPI1640培养基，置于体积分数5% CO2，37 ℃的细胞培养箱内培养?将细胞按1×106密度接种于35 mm培养皿中，以100 ng/mL的PMA刺激THP-1细胞48 h后诱导其分化成巨噬细胞?实验分组如下:在观察过表达miR-155对巨噬细胞的影响时分为6组:空白对照组?Ad-LacZ组?ox-LDL+Ad-LacZ组?ox-LDL+Ad-miR-155(25 MOI)组?ox-LDL+Ad-miR-155(50 MOI)组?ox-LDL+Ad-miR-155(100 MOI)组;在观察抑制miR-155对巨噬细胞的影响时分为4组:Ad-LacZ组?Ad-anti-miR-155(50 MOI)组?ox-LDL+Ad-LacZ组?ox-LDL+Ad-anti-miR-155(50 MOI)组?
1.5 实时定量PCR检测ox-LDL对miR-155表达的影响
参照操作手册，用Trizol法抽提总RNA?2 μg总RNA逆转录至终体积为20 μL，采用SYBR Green实时荧光PCR方法检测miR-155的表达?用miR-155特异性的具有茎环样结构的引物5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC-CGAGGTATTCGCAC TGGATACGACCCCCTA-3’合成互补的DNA，检测miR-155的表达?定量多聚酶链反应(qPCR)引物设计，正向引物:5’-CTGTTAATGCTAATCGTGAT AG-3’;反向引物5’-GCAGGGTCCGAGGT-3’?核内小分子RNA U6作为内参，引物设计如下，正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’?PCR反应体系包括:1 μL RT逆转录产物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正向以及反向引物?反应采用MyiQ单色实时PCR检测系统(Bio-Rad)，先95 ℃孵育30 min，然后进行40个循环(95 ℃10 s， 60 ℃ 30 min)?U6做为内参，采用2-△△CT法分析基因相对表达量?
1.6 Western Blot检测 SR-A 和CD36蛋白表达情况
总蛋白的提取:用冰浴的PBS洗涤细胞3遍，加入RIPA裂解液100 μL，冰上裂解30 min?刮下并收集细胞，4 ℃，12 000 r/min(r=9.5 cm)离心10 min，吸取上清液，用BCA法进行蛋白质定量，-80℃保存?Western Blot检测SR-A和CD36蛋白表达:以 60 μg蛋白每泳道上样，经8% SDS-PAGE 电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h 后，一抗(SR-A，1∶4 000;CD36，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜; TBST洗涤3次，每次5 min，二抗(HRP标记的驴抗山羊IgG 1∶4 000;1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST 洗涤3次，每次10 min?ECL化学发光法检测蛋白表达，以β-actin为内参，计算蛋白表达的相对变化?
1.7 激光共聚焦显微镜观察miR-155对巨噬细胞结合?摄取DiI-oxLDL能力的影响
按文献报道的方法进行[10]，主要步骤简述如下:病毒转染24 h后，加入ox-LDL处理细胞48 h?随后各组分别加入终浓度为10 μg/mL的DiI-oxLDL，于4 ℃下孵育细胞2 h(反映巨噬细胞结合DiI-oxLDL能力)或37 ℃下孵育细胞4 h(反映巨噬细胞摄取DiI-oxLDL能力)，经40 g/L多聚甲醛固定10 min后，加入终浓度5 mg/L的Hoechst33258避光染色5 min，PBS洗涤3次后，激光共聚焦显微镜下(600×)观察拍摄?各组随机选取5个视野，运用confocal自带Fluorescence View软件测定视野内所有细胞的细胞内平均荧光强度并计算平均值?
1.8 数据分析和统计
所有实验结果用均数±标准差(x ± s)表示?采用SPSS 13.0进行统计学分析，多组资料比较采用方差分析，两两比较采用t检验，P&<0.05表示差异有统计学意义?
2 结 果
2.1 Ox-LDL诱导巨噬细胞miR-155表达上调
实时定量PCR结果显示，在THP-1细胞，80 μg/mL的ox-LDL可以诱导miR-155的表达上调?Ox-LDL作用后2 h，miR-155表达开始增加，6 h达到最高?尽管8 h开始有所降低，但ox-LDL作用后一直到72 h，miR-155表达仍维持在较高表达水平(图1)?
2.2 过表达miR-155抑制巨噬细胞结合?摄取DiI-oxLDL
为明确ox-LDL诱导miR-155表达上调的功能，我们观察了腺病毒转染miR-155(Ad-miR-155)后对巨噬细胞结合和摄取DiI-oxLDL的影响?结果显示，与对照组相比，ox-LDL处理细胞48 h后，巨噬细胞摄取DiI-oxLDL的能力明显增加?Ox-LDL处理后细胞内的平均荧光强度从对照组的262±25增加至433 ± 29(n=6， P &< 0.05)?Ad-miR-155转染可明显抑制巨噬细胞摄取DiI-oxLDL的能力?Ad-miR-155不同滴度(25 MOI，50 MOI，100 MOI)转染后，细胞内平均荧光强度分别降至353 ± 22(n=6，P &< 0.05)，285 ± 11(n=5， P &< 0.01)和247 ± 12(n=6，P &< 0.01)?而Ad-LacZ转染无作用(图2A)?
同时我们观察到，ox-LDL处理细胞48 h后，巨噬细胞结合DiI-oxLDL的能力亦明显增加?Ox-LDL处理后细胞内的平均荧光强度从对照组的84 ± 6增加至221 ± 12(n=6， P &< 0.05)?Ad-miR-155转染(50 MOI)可明显抑制巨噬细胞与DiI-oxLDL的结合，Ad-miR-155转染使细胞内的平均荧光强度降至146 ± 16(n=6， P &< 0.01)(图2B)?
2.3 抑制miR-155促进巨噬细胞结合?摄取DiI-oxLDL
为进一步明确miR-155对巨噬细胞结合和摄取DiI-oxLDL的影响?我们研究了腺病毒转染反义-miR-155(Ad-anti-miR-155)的作用?图3A显示，Ad-anti-miR-155转染(50 MOI)后，基础状态和ox-LDL刺激后的巨噬细胞摄取DiI-oxLDL的能力均明显增强?Ad-anti-miR-155作用后，基础状态下，细胞内的平均荧光强度从Ad-LacZ转染组的292 ± 26增加至明显增加402 ± 34(n=5，P &< 0.05)?Ox-LDL处理后，细胞内平均荧光强度较对照组增加(481 ± 33 vs. 292 ± 26， n=5，P &< 0.05)?Ad-anti-miR-155转染可进一步增强oxLDL的作用，使细胞内平均荧光强度增加至559 ± 34(n=5， P &< 0.05)?另一方面，巨噬细胞结合DiI-LDL的能力也明显增加?在基础状态下和和ox-LDL刺激后，Ad-anti-miR155转染分别使巨噬细胞内的平均荧光强度从142 ± 7增加至 190 ± 10(n=5，P&<0.05)以及从289 ± 13增加至372±24(n=5，P&<0.05)(图3B)?
转贴于2.4〓过表达miR-155降低了SR-A和CD36的表达
由于巨噬细胞摄取脂质主要通过膜上的清道夫受体完成，因此，我们进一步分析了腺病毒转染miR-155(Ad-miR-155)后对巨噬细胞SR-A和CD36表达的影响?结果发现，随Ad-miR-155转染滴度的增加，SR-A和CD36的表达逐渐降低?MiR-155不仅抑制基础状态下SR-A和CD36的表达，而且逆转ox-LDL诱导的SR-A和CD36蛋白表达的上调(图4A，图4B)?
2.5 抑制miR-155上调SR-A和CD36的表达
进一步我们观察了抑制miR-155对巨噬细胞清道夫受体表达的影响?Western Blot结果显示，与对照组相比，转染Ad-anti-miR155(50 MOI)可显著增加基础状态下巨噬细胞中SR-A和CD36的表达，差异具有统计学意义(n=6，P &< 0.05)(图5A)?加入ox-LDL刺激巨噬细胞后，SR-A和CD36的表达上调?预先转染Ad-anti-miR155 (50 MOI)，可进一步增加SR-A和CD36的表达上调(n=6，P &< 0.05)(图5B)?
3 讨 论
MicroRNA 是一类长约 18~24 个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与特异性靶基因 mRNA的3′-UTR 区结合，抑制其翻译或使其降解，从而调控目的基因的表达?MicroRNA在细胞增殖?凋亡?分化，胚胎发育和免疫应答等过程中发挥着重要的作用，与机体多种疾病尤其是心血管疾病的发生发展密切相关[11]?如在心血管组织中特异性高表达的miR-1?miR-133 和 miR-208等，其表达异常均可导致心脏发育缺陷[12]?
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其发生发展过程中，是否也受到了microRNA的调控，成为近年来的研究热点[13]?MiR-155位于非编码基因Bic内，在血液细胞中高表达?已有研究表明miR-155参与调控T淋巴细胞?B淋巴细胞和树突状细胞的分化，从而影响机体的免疫功能?在单核巨噬细胞，一些促炎因子如TNFα，LPS等可通过NF-κB信号通路上调miR-155的表达?提示miR-155可能参与调控了机体的炎症反应过程?已往研究发现，在ox-LDL刺激的巨噬细胞中，miR-125a-5p?miR-146和miR-155等的表达上调[4]?但miR-155是否影响巨噬泡沫细胞的形成，尚不清楚?
最近，Huang等[14]发现ox-LDL诱导miR-155上调可能参与了巨噬泡沫细胞的形成，抑制miR-155表达可抑制巨噬细胞内脂质的聚集?该作用与LOX-1，CD36和CD68的表达上调有关?但miR-155对细胞膜上清道夫受体的功能以及对基础状态下巨噬细胞摄取脂质的影响，尚不明了?为了进一步阐明miR-155在巨噬泡沫细胞形成中的作用，本研究中，我们从过表达和下调miR-155表达两个不同的角度，探讨了miR-155对基础状态下和ox-LDL处理后的巨噬细胞结合和摄取脂质的能力以及细胞膜上清道夫受体表达的影响?我们发现ox-LDL可以诱导巨噬细胞miR-155表达上调?由于巨噬细胞吞噬大量脂质形成泡沫细胞是动脉粥样硬化形成的关键环节，因此我们通过转染miR-155和反义miR-155病毒，上调或抑制巨噬细胞上miR-155的表达，观察其对细胞结合和摄取DiI-oxLDL能力的影响?结果发现，无论是基础状态还是ox-LDL处理后，过表达miR-155均可明显抑制巨噬细胞对DiI-oxLDL的结合和摄取;而抑制miR-155则促进巨噬细胞结合和摄取DiI-oxLDL?这些结果说明miR-155表达的上调可抑制巨噬泡沫细胞的形成?已知巨噬细胞对脂质的结合和摄取主要是通过膜上的清道夫受体SR-A和CD36等实现的，所以我们进一步分析了miR-155对SR-A和CD36蛋白表达的影响?我们的结果显示过表达miR-155，不仅抑制基础状态下SR-A和CD36的表达，而且逆转了ox-LDL诱导的 SR-A和CD36的表达上调;而抑制miR-155则明显上调SR-A和CD36的表达?这些结果表明miR-155通过下调SR-A和CD36的表达，影响巨噬细胞对脂质的结合?摄取，从而抑制巨噬细胞泡沫化过程?但miR-155影响SR-A和CD36表达的具体机制，尚不清楚?我们的资料提示ox-LDL作用于巨噬细胞，一方面通过激活氧化应激系统等信号通路，促进巨噬泡沫细胞的形成?同时亦可激活抑制泡沫化形成的机制(如上调miR-155表达等)?ox-LDL最终影响巨噬细胞泡沫化形成取决于上述两种因素的相互作用?
总之，本研究发现miR-155可通过下调巨噬细胞上清道夫受体如SR-A和CD36等的表达，抑制巨噬泡沫细胞的形成?提示miR-155可能是防治巨噬细胞泡沫化，进而防治动脉粥样硬化的新靶点?
【
参考文献
】Kunjathoor VV， Febbraio M， Podrez E A， et al. Scavenger receptors class A-I/II and CD36 are the principal receptors responsible for the uptake of modified low density lipoprotein leading to lipid loading in macrophages[J]. J Biol Chem， 2002， 277(51): 49982-49988.
孙吉，陈小平. microRNA与心血管疾病的关系[J]. 分子诊断与治疗杂志， 2011(3): 192-199.
Faraoni I， Antonetti FR， Cardone J， et al. miR-155 gene: a typical multifunctional microRNA[J]. Biochim Biophys Acta， 2009， 1792(6): 497-505.
Chen T， Huang Z， Wang L， et al. MicroRNA-125a-5p partly regulates the inflammatory response， lipid uptake， and ORP9 expression in oxLDL-stimulated monocyte/macrophages[J]. Cardiovasc Res， 2009， 83(1): 131-139.
Yan G， You B， Chen SP， et al. Tumor necrosis factor-alpha downregulates endothelial nitric oxide synthase mRNA stability via translation elongation factor 1-alpha 1[J]. Circ Res， 2008， 103(6): 591-597.
Redgrave TG， Roberts DC， West CE. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifug-ation[J]. Anal Biochem， 1975， 65(1-2): 42-49.
Tribble DL， Krauss RM， Lansberg MG， et al. Greater oxidative susceptibility of the surface monolayer in small dense LDL may contribute to differences in copper-induced oxidation among LDL density subfractions[J]. J Lipid Res， 1995， 36(4): 662-671.
Pitas RE， Innerarity TL， Weinstein JN， et al. Acetoacetylated lipoproteins used to distinguish fibroblasts from macrophages in vitro by fluorescence microscopy[J]. Arteriosclerosis， 1981， 1(3): 177-185.
Oram JF. HDL apolipoproteins and ABCA1: partners in the removal of excess cellular cholesterol[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003， 23(5): 720-727.
Ricci R， Sumara G， Sumara I， et al. Requirement of JNK2 for scavenger receptor A-mediated foam cell formation in atherogenesis[J]. Science， 2004， 306(5701): 1558-1561.
Ono K， Kuwabara Y， Han J. MicroRNAs and cardiovascular diseases[J]. FEBS J， 2011， 278(10): 1619-1633.
Zhao Y， Ransom JF， Li A， et al. Dysregulation of cardiogenesis， cardiac conduction， and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2[J]. Cell， 2007， 129(2): 303-317.
陈妍梅，李浪. microRNA与动脉粥样硬化炎症反应[J]. 中国动脉硬化杂志， 2010(8): 662-664.
Huang RS， Hu GQ， Lin B， et al. MicroRNA-155 silencing enhances inflammatory response and lipid uptake in oxidized low-density lipoprotein-stimulated human THP-1 macrophages[J]. J Investig Med， 2010， 58(8): 961-967.
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