张瑞 习勉 李巧巧 赵磊 黄晓波 何立儒 胡永红 刘孟忠
【摘要】 【目的】 比较容积旋转调强(VMAT)?静态调强(sIMRT)与三维适形放疗 (3DCRT) 技术在胸上段食管癌的剂量学差异?【方法】 选取7例局部晚期胸上段食管癌患者，分别制定3DCRT?7野sIMRT和360度单弧VMAT 3套放疗计划，处方剂量统一为60 Gy/30F?比较靶区?危及器官的剂量体积参数，加速器的总机器跳数(MU)和有效治疗时间(TT)等? 【结果】 VMAT与IMRT的靶区剂量分布基本一致，均优于3DCRT?对于正常组织，三组计划中肺?心脏的受照剂量均无明显差异，但IMRT与VMAT可较3DCRT更好的保护脊髓?3DCRT?IMRT?VMAT的MU分别为537 ± 92?601 ± 122?682 ± 139，有效治疗时间(min)分别为 3.9 ± 0.3?6.0 ± 0.7?4.7 ± 0.7 (P &< 0.05)?【结论】 与3DCRT相比，VMAT与IMRT在胸上段食管癌均有一定的剂量学优势，但VMAT较IMRT可显著提高治疗效率?
【关键词】 放射治疗; 食管肿瘤; 容积旋转调强; 静态调强; 剂量学
Abstract: 【Objective】 A planning study was performed to compare volumetric modulated arc therapy (VMAT)， static intensity-modulated radiotherapy (sIMRT)， and three-dimensional conformal radiotherapy (3DCRT) for upper thoracic esophageal cancer. 【Methods】 Seven patients with loco-regionally advanced upper thoracic esophageal cancer were included. Based on the identical CT and planning target volume (PTV)， three plans (3DCRT， sIMRT with seven fields， VMAT with a single arc) were generated. Dose prescription was set to 60Gy in 30 fractions. Dose volume histograms， MU and delivery time were evaluated to assess plan quality. 【Results】 In comparison to 3DCRT， both VMAT and IMRT provided a systematic improvement in PTV coverage. For normal tissues， equivalent sparing of lung and heart were achieved with three plans. However， IMRT and VMAT showed a superior sparing compared with 3DCRT for spinal cord. The MU/fraction was as follows: 537 ± 92 for 3DCRT， 601 ± 122 for IMRT， and 682 ± 139 for VMAT. Effective treatment time for 3DCRT， IMRT and VMAT were (3.9 ± 0.3) min，(6.0 ± 0.7) min and (4.7 ± 0.7)min， respectively (P &< 0.05). 【Conclusions】 Compared with 3DCRT， IMRT and VMAT showed better dosimetric quality and superior spinal cord sparing. However， VMAT improved delivery efficiency significantly than IMRT.
Key words: radiotherapy; esophageal neoplasm; volumetric modulated arc therapy; intensity-modulated radiotherapy; dosimetry
滑膜肉瘤是一种显示一定程度上皮分化的间叶组织梭形细胞肿瘤，占软组织肉瘤的5% ~ 10%，主要发生于年轻人?组织学可分为双相型和单相型，且两种类型都可能存在低分化的成分，由于发病部位广泛[1-2]，免疫组化缺乏特异的抗体，经常造成病理鉴别诊断的困难?细胞和分子遗传学研究发现，在90%的滑膜肉瘤中存在特异性的染色体易位t(X; 18)(p11.2; q11.2)[3]，并产生融合性基因SYT-SSX?我们采用FISH方法对病理学确诊滑膜肉瘤?高度疑为滑膜肉瘤及非滑膜肉瘤共168例肿瘤石蜡包埋组织SS18易位基因进行检测，探讨其对滑膜肉瘤的诊断和鉴别诊断价值?
1 材料与方法
1.1 材 料
收集中山大学附属肿瘤医院病理科2005-2011年间确诊为滑膜肉瘤75例，高度疑为滑膜肉瘤33例，其中手术标本87例，活检或穿刺标本21例;非滑膜肉瘤60例，包括恶性纤维组织细胞瘤8例?纤维肉瘤8例?上皮样肉瘤8例?恶性周围神经鞘膜瘤8例?恶性黑色素瘤4例?肉瘤样癌4例?多形性脂肪肉瘤4例?尤文氏肉瘤4例?平滑肌肉瘤4例?上皮样血管内皮瘤4例?低分化癌4例?所有标本均为40 g/L多聚甲醛液固定?石蜡包埋?HE染色重新阅片?免疫组织化学采用EnVision两步法，所用抗体CK?EMA?Vim?S-100?CD99购自福州迈新生物技术开发有限公司?
1.2 FISH检测
LSI SS18 Dual Color Break-Apart Rearrangement Probe (Vysis， Abbott Laboratories Inc)探针为双色断裂分离探针，在基因的5’端设计一个长650 kb探针，用橘红色标记;在基因3’端设计一个长1 040 kb探针， 用绿色标记?①标本处理:切取5 μm石蜡切片于60 ℃烤片过夜，常规脱蜡至水化?在EDTA-Tris溶液(pH=7.0)中煮片20 min，再于蛋白酶K溶液中37 ℃消化8 min，依次经70 mL/L?850 mL/L?无水乙醇脱水后，自然干燥?②FISH :取PathVysion SSX18探针试剂盒7 μL探针混合液滴于已处理的组织标本上，盖上盖玻片，水泥胶封片?将玻片放入原位杂交仪(thermoBrite hybridizer)，80 ℃共变性5 min后，37 ℃杂交过夜?次日取出玻片，去掉水泥胶，在2×SSC及2×SSC/0.1%NP40溶液中各洗涤7 min，自然干燥?DAPI复染，在OLMPUS BX 51荧光显微镜下观察，通过Video Test FISH 2.0软件进行图像合成?③结果判读:观察肿瘤细胞信号时选择核边界完整?细胞核孤立无重叠?杂交信号清晰的细胞核?将组织切片分为四个象限，每个象限随机计数100个细胞?橘色信号与绿色信号的距离不小于单个信号直径的2倍时，视为分离信号;细胞核内出现成对橘色和绿色信号， 同时橘色和绿色信号非常接近(橘?绿信号之间的距离小于单个信号直径的2倍)或重叠形成黄色信号视为正常;如果一个细胞核中存在1对融合信号与1对分离信号， 则为SS18基因易位阳性细胞?计算每个病例的阳性细胞百分率，根据60例非滑膜肉瘤的SS18基因易位阳性细胞百分率，计算均数+3倍标准差，得到判断融合基因是否存在的阈值?
2 结 果
2.1 临床病理及免疫组织化学染色结果
108例肿瘤病例中75例确诊为滑膜肉瘤，33例高度疑为滑膜肉瘤?男性67例，女性41例?年龄最大74岁，最小13岁，平均36岁?肿瘤发生部位以四肢最多见，共78例(上肢43例，下肢35例)，头颈部9例，腹壁5例，肺5例?肾2例，余散在发生部位9例?肿瘤直径大小2.5 ~ 8 cm，平均4.2 cm?在75例确诊滑膜肉瘤中，单相型53例?双向型13例?低分化型9例;CK和EMA的阳性率分别为62.7%(47/75)和88.0%例(66/75)?33例高度疑为滑膜肉瘤中，组织学上可能为单相型16例?可能为双向型3例?可能为低分化型14例?CK和EMA的阳性率分别为45.5%(15/33)和39.4%(13/33)，S-100?CD99阳性率为21.2%(7/33)?45.5%(15/33)?Vim在全部病例中阳性表达，
2.2 FISH结果
在进行检测的168例样本中，1例确诊滑膜肉瘤及2例疑似滑膜肉瘤标本因杂交信号弱无法判读;其余165例，129例(78.2%)可见两对杂交信号，36例(21.8%)部分肿瘤细胞可见两对以上杂交信号(即多拷贝数)，其中滑膜肉瘤20例，滑膜肉瘤疑似病例7例，非滑膜肉瘤9例?
60例非滑膜肉瘤，SS18基因易位阳性细胞百分率为1% ~ 10%[(5.31 ± 2.41)%](图1A)，以Mean ± 3SD为阈值，即将阳性细胞百分数大于13%(5.31% + 3 × 2.41%)作判断病例呈SS18基因易位阳性的标准?在105例滑膜肉瘤病例中85例(81.0%)可检测到SS18易位基因(其中65例SS18基因为二体性，20例为多拷贝数)，存在分离信号的阳性细胞百分率从16%~92%不等，但73例阳性细胞百分率均在70%以上?
在74例确诊滑膜肉瘤样本中63例(85.1%)可检测到SS18易位基因(图1B)，其中双相型滑膜肉瘤中上皮样细胞和梭形细胞均可观察到分离信号;余11例判读为阴性的病例中7例分离信号细胞比例&<10%(其中1例无分离信号)，4例存在分离信号细胞比例为10%~13%，综合HE切片及免疫组化结果，仍诊断为滑膜肉瘤?31例疑为滑膜肉瘤样本中22例(71.0%)检测到SS18易位基因，并最终确诊为滑膜肉瘤，余9例经重新结合HE及免疫组化观察后考虑为纤维肉瘤4例?低分化癌2例及PNET 1例?
2.3 FISH结果与免疫组化染色结果的关系
在FISH检测阳性的85例滑膜肉瘤中，CK和EMA的阳性率分别为56.5%(48/85)和77.7%(66/85)?FISH检测阴性的20个病例中，CK和EMA的阳性率均为55.0%(11/20)?
3 讨 论
病理诊断过程中，免疫组化染色上皮标志物(如CK或EMA)和间叶标志物(如Vim)的组合搭配经济?有效，在一定程度上有利于滑膜肉瘤的诊断和鉴别诊断?但是，除双相型滑膜肉瘤外，CK和EMA在单相型及低分化型滑膜肉瘤中表达较低甚至不表达，Vim在部分低分化癌及几乎全部的软组织肿瘤中阳性表达，对鉴别没有意义?本研究无选择性收集108例可能为滑膜肉瘤病例，除75例经病理学专家反复阅片并结合形态学及免疫组化染色可以确诊外，余33例高度疑为滑膜肉瘤，其中Vim全部阳性，CK和EMA的阳性率分别为45.5%和39.4%，无法与纤维肉瘤?PNET?低分化癌等恶性肿瘤进一步鉴别?
细胞和分子遗传学研究显示，在90%的滑膜肉瘤中存在特异性的染色体易位t(X;18)(p11.2; q11.2)[3]，并产生融合性基因SYT-SSX[4]?由于滑膜肉瘤中存在即SSX1-?SSX2-及SSX4-三种不同的融合亚型[5-7]，根据研究，只有滑膜肉瘤发生发展才能特异性的出现SS18基因的易位，从而形成蛋白?所以在本研究中采用FISH技术，特异性的针对SS18基因，使用分离型探针涵盖不同的亚型，更加全面地获取到基因断裂结果;加之，实验过程关键点易调整控制?标本大小及保存年限要求不高?结果直观且不存在非特异性等优势，FISH较之传统的Southern blot和RT-PCR法从石蜡包埋组织中检测染色体易位更方便于临床病理诊断?本研究收集的108例样本仅3例因杂交信号较弱，无法分析，其余通过荧光显微镜均可见完整组织细胞形态及清晰的杂交信号，且单例检测时间仅需1 ~ 2 d，检测效率高?
本研究中74例确诊的滑膜肉瘤中85.1%的病例可以检测到SS18基因易位，与Amary等[8]报道的结果(86%)相近，比成凡宇等[9]报道的结果(78.5%)略高;对于基因易位检测阴性的11例(14.9%)，我们复查其HE及免疫组化切片，由于镜下形态较典型，免疫标记也符合滑膜肉瘤，仍诊断为滑膜肉瘤?
有研究者把&>90%细胞核出现易位信号定义为SS18基因易位阳性病例[7]，而在我们的检测中发现排除正常细胞的干扰，存在易位信号的阳性细胞百分率从16%~92%不等，虽然绝大部分阳性细胞百分率大于70%，但Amary[8]?Sun[10]等也同样发现部分SS易位信号比例较低的情况，考虑是由于肿瘤的遗传异质性所导致?
本研究确诊的74例滑膜肉瘤中有11例FISH未能检测出SS18的分离信号?分析原因一是肿瘤基因的复杂性，当参与融合的基因较为不在商业化探针标记的范围内时，二是阳性判断标准的难以确定，国际上至今没有指定规范化的FISH结果阳性的判读标准?Sun等[10]通过计算制定了能兼顾特异性和敏感性的SSR值和阈值，认为超过15%或Ratio&>16.39%的细胞出现分离信号即可判读为阳性;成凡宇[9]及Amary[8]又根据各自观察情况分别采用90%及20%的标准?本实验室通过固定切片人员及计数人员，以60例非滑膜肉瘤SS18基因分离信号百分率为依据，根据Sun 等[10]的计算方式，建立本实验室的观察阈值，我们认为对检测结果的质量控制具有较高的可信度，而在检测为阴性的病例中有4例分离信号细胞百分率为10% ~ 13%，较为接近阈值，根据严格质量控制，最终判读为阴性，因而实验室的检测数据及判读经验均需进一步积累?所以FISH检验阴性的病例应结合形态学?免疫组化及临床资料的综合分析?
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