邵明明 苏嘉 陈泽楷 杜雨末 金希 谈智
【摘要】 【目的】在高脂诱导的胰岛素抵抗大鼠模型上，探讨微囊蛋白3(CAV-3)在白藜芦醇改善骨骼肌胰岛素抵抗中的作用及机制?【方法】 实验大鼠分3组:正常饮食组(NORM)，高脂饮食组(HFD)，高脂饮食加白藜芦醇干预组(HFD+ RSV)?通过空腹血糖?胰岛素浓度?计算胰岛素敏感指数?腹腔葡萄糖耐量试验以及2-脱氧-[3H] 葡萄糖的摄取，从整体上探讨白藜芦醇对胰岛素抵抗的保护作用?再通过免疫印迹检验微囊蛋白3(CAV-3)与葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)在以上过程中的表达情况?【结果】 HFD能显著诱导胰岛素抵抗，补充RSV能抑制高脂的诱导作用?离体骨骼肌实验证实，RSV的保护作用与其促进胰岛素诱导的葡萄糖摄取有关?免疫印迹证实RSV能够增加骨骼肌CAV-3蛋白表达，促进GLUT4向细胞膜的转运?【结论】 白藜芦醇能改善高脂诱导的胰岛素抵抗，其保护作用与其上调CAV-3蛋白表达，促进GLUT4向细胞膜转运，改善骨骼肌葡萄糖的摄取有关?
【关键词】 白藜芦醇; 胰岛素抵抗; 微囊蛋白; 葡萄糖转运蛋白4
Abstract:【Objective】 In the high-fat-induced insulin resistance rat model， the role of caveolin-3 (CAV-3) in the effect of resveratrol (RSV) on insulin resistance in skeletal muscles was studied. 【Methods】 Rats were pided into three groups: normal diet group (NORM)， high-fat diet group (HFD)， high-fat diet plus resveratrol group (HFD + RSV). The protective effect of resveratrol on insulin resistance were studied by measuring fasting glucose， fasting serum insulin， insulin sensitive index (ISI)， intraperitoneal glucose tolerance test， and 2-deoxy-[3H] glucose uptake in vitro soleus muscles. Expression of caveolin-3 (CAV-3) and glucose transporter 4 (GLUT4) in the above processes were measured by Western blot analysis. 【Results】 RSV has protective effect on high-fat diet-induced insulin resistance. RSV elevated insulin-stimulated glucose uptake in isolated soleus muscle in vitro by enhancing GLUT4 translocation to the plasma membrane rather than increasing GLUT4 protein expression. RSV increased CAV-3 protein expression， which contributed to GLUT4 translocation. 【Conclusion】 The results showed that RSV ameliorates insulin resistance by increasing glucose uptake in skeletal muscles through a CAV-3-dependent pathway， and the mechanism was that RSV up regulates CAV-3 protein expression and enhances GLUT4 translocation to plasma membrane.
Key words: resveratrol; insulin resistance; caveolin-3; glucose transporter 4
骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells， MSC)是一种多能干细胞，不但具有多向分化潜能，还具有免疫调节作用?近来研究表明[1-2]，MSC可以延长多种移植物的存活时间?我们前期研究显示[3]，用白细胞分化抗原40配体免疫球蛋白(CD40LIg)阻断T细胞共刺激通路可抑制异种胰岛移植的排斥反应，但不能维持移植物的长期存活?同样，有研究显示单独使用MSC也不能维持移植物的长期存活[4]?因此，我们建立Wistar-SD大鼠异种胰岛移植模型，用CD40LIg基因修饰的MSC进行干预治疗，同时发挥CD40LIg和MSC的作用，探讨CD40LIg基因修饰的MSC在异种胰岛移植排斥反应中的作用?
1 材料与方法
1.1 材 料
雄性Wistar大鼠，体质量约200~250 g，作为胰岛细胞和骨髓间充质干细胞(MSC)供体;雄性SD大鼠，体质量约200~250 g，为胰岛移植的受体(由中山大学医学动物实验中心提供);抗CD40LIg单克隆抗体?抗胰岛素单克隆抗体?免疫组织化学试剂盒和ELISA试剂盒(由深圳晶美生物有限公司提供);携带分泌型CD40LIg基因的重组腺病毒载体质粒由本中心构建;Ficoll 400试剂(由瑞典Amersham 公司提供)?
1.2 胰岛的分离和纯化
Wistar大鼠在100 g/L水合氯醛(按体质量40 mg/kg)麻醉下，开腹经胆总管插管灌注胶原酶，等胰腺肿胀后切取胰腺，将胰腺剪成小块置入消化器中，37.5℃消化5~8 min，收集消化产物?将消化物在37 ℃?体积分数为5% CO2的恒温培养箱中培养48 h后，用25%?23%?20%?11% 的Ficoll 400不连续密度梯度液进行纯化，将纯化产物置于30 ℃?体积分数为5%CO2的恒温培养箱中培养备用?
1.3 骨髓间充质干细胞(MSC)分离和培养
Wistar大鼠拉颈处死后取股骨与胫骨进行分离，制成骨髓细胞悬液，并与等量DMEM混合后离心，再加入Percoll分离液离心，抽取有核细胞层，加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM，接种于培养瓶中，置于37 ℃?体积分数为5% CO2的恒温培养箱中培养?接种48 h后更换培养液，之后每隔3 d更换一次培养液?待培养细胞接近80%融合后，再用0.25%胰酶消化，传代培养至第5代细胞备用?
1.4 骨髓间充质干细胞AdCD40LIg转染
用多重感染复数(MOI)为100的重组5型野生型腺病毒AdCD40LIg病毒液感染MSC(转染率达90%以上)，置于37 ℃?体积分数为5% CO2的恒温培养箱内培养48 h后，备用?
1.5 异种胰岛移植模型和实验分组
将AdCD40LIg转染的MSC和Wistar大鼠胰岛细胞用培养液调整细胞浓度分别为4×106个/mL和 8 000 IEQ/mL?将45只用静脉注射链脲佐菌素造模成功的糖尿病大鼠随机分为A?B?C 3组(每组15只)，在100 mg/L水合氯醛(按体质量40 mg/kg)麻醉下，将0.25 mL AdCD40LIg转染的MSC(约1×106 个MSC)和0.25 mL胰岛细胞悬液(约2 000 IEQ胰岛细胞)注入左肾被膜下?A组仅植入胰岛细胞，作为对照组; B组植入胰岛细胞和MSC;C组植入胰岛细胞和AdCD40LIg转染的MSC?
1.6 观察指标
移植后观察移植大鼠的一般情况和存活情况;第1周内每天检测1次血糖，从第2周开始每隔2 d测1次血糖?当血糖恢复正常后，如连续2次血糖高于16.0 mmol/L，以第1次时间为排斥反应开始?在移植前1 d和移植后3?7?14?21?28?35 d分别采取胰岛移植大鼠外周血，采用ELISA方法检测TNF-α和IL-2的水平?分别于胰岛移植后15 d和30 d，取移植大鼠移植物，作病理组织学检查;用SP免疫组织化学染色法检测移植物CD40LIg和胰岛素蛋白的表达?
1.6 统计学方法
数据以表示，SPSS 11.0软件进行统计分析，采用t检验和单因素方差分析分别进行两组样本均数和多组样本均数的比较，P&<0.05为差异有统计学意义?
2 结 果
2.1 糖尿病大鼠胰岛移植后血糖的变化
糖尿病大鼠血糖平均在胰岛移植后2 d恢复正常，对照组血糖平均在移植后7 d开始升高;单纯MSC组和基因转染MSC组血糖分别在移植术后20 d和47 d升高?
2.2 移植糖尿病大鼠和胰岛移植物存活情况
对照组?单纯MSC组和基因转染MSC组移植物存活时间分别为(9.5 ± 3.2)d?(25.2 ± 5.3)d和(53.6 ± 7.5)d，各组间比较具有显著差异(F=5.362，P &< 0.05);移植糖尿病大鼠生存时间分别为(24.1 ± 6.8)d?(51.7 ± 7.9)d?(95.2 ± 12.7)d，各组间比较差异具有显著性(F=6.821，P &< 0.05)?
2.3 糖尿病大鼠胰岛移植后细胞因子的变化
对照组在移植后IL-2和TNF-α的水平快速上升，而IL-4和IL-10的水平较移植前显著下降(P &< 0.01);2个治疗组细胞因子水平的变化和对照组正好相反(图1)?
2.4 胰岛移植物病理学检查和免疫组织化学染色结果
转贴于移植后15 d，两个治疗组移植物内均可见成片的胰岛细胞团，无明显的淋巴细胞浸润;免疫组化染色可见胰岛素蛋白的表达(图2A);而对照组移植物可见的胰岛细胞坏死和大量淋巴细胞浸润(图2B)?移植后30 d，基因转染MSC组移植物内可见成片的胰岛细胞，无明显的淋巴细胞浸润;并可见棕黄色的胰岛素和CD40LIg蛋白的表达(图2C)?MSC组则见胰岛细胞变性?坏死，大量淋巴细胞浸润?
3 讨 论
排斥反应目前仍是影响胰岛移植疗效的主要因素，而排斥反应的免疫应答过程主要由T淋巴细胞介导完成?骨髓间充质干细胞(MSC)是一类骨髓来源的多能干细胞，具有低免疫原性和免疫调节功能?多种体外实验研究均证实MSC可抑制T淋巴细胞的增殖[5-8]?有研究报道[8]，在MSC和T淋巴细胞的混合培养中，由丝裂原刺激的T细胞增殖被抑制，并且这种抑制作用在去除BMSC后消失?
通过建立异种胰岛移植模型，用MSC进行干预治疗，结果显示MSC组的胰岛移植糖尿病大鼠和移植物的生存时间较对照组显著延长，排斥反应明显被抑制?MSC抑制胰岛移植排斥反应的机理还不清楚?有研究显示[9]，移植前输注MSC可通过抑制T细胞的增殖，延长心脏移植的存活时间?同样也有研究表明[10]，MSC可调节T淋巴细胞的扩增，抑制大鼠肝脏移植的排斥反应的发生?有学者认为MSC抑制胰岛移植排斥反应的机理可能和诱导辅助性T细胞(Th)细胞的分化偏移有关?Th1型细胞主要生成IL-2?TNF-α和INF-γ，参与细胞免疫，促进排斥反应的发生;Th3型细胞产生IL-4?IL-10等细胞因子，参与体液免疫; Th1和Th3亚群之间可以相互调节和互相转化，Th3型细胞生成的IL-4可下调Th1的扩增，而Th1型细胞产生的INF-γ则下调Th3的增殖?
本研究显示，对照组IL-2和TNF-α的水平在移植后急剧升高，移植术后7 d达到高峰，IL-4和IL-10水平较移植前下降;而两个治疗组细胞因子的变化则和对照组相反，证实MSC可抑制Th1类细胞因子IL-2和TNF-α的产生，促进Th3类因子IL-4和IL-10的生成?有报道人MSC可抑制Th1类细胞因子IL-2和TNF-α产生，促进Th3类因子IL-4和IL-10生成，诱导Th1向Th3分化偏移，抑制排斥反应的发生[11]?
本研究还发现，MSC治疗虽然可抑制胰岛移植排斥反应，但不能使移植大鼠获得长期的存活?而用CD40LIg基因转染MSC治疗的胰岛移植大鼠和移植物存活时间较MSC治疗组和对照组显著延长?CD40L是CD40的配体，属于TNF超家族成员，主要在CD4+ T细胞上表达，与CD40分子结合，为T细胞的活化提供共刺激信号?CD40LIg可阻断T细胞的活化重要的CD40/CD40L共刺激途径，抑制T细胞介导的排斥反应?我们前期研究表明[3]，基因转移CD40LIg可以通过阻断T细胞的活化的共刺激通路和下调相关Th1类细胞因子的表达，抑制异种胰岛移植大鼠的排斥反应，但不能形成免疫耐受?这可能与排斥反应是一个复杂的和多途径的免疫过程有关，所以单独阻断任何一条途径都不能获得稳定的效果?
因此，我们转移CD40LIg基因修饰MSC对异种胰岛移植大鼠进行干预治疗，通过CD40LIg阻断T细胞的活化的共刺激通路，发挥MSC免疫调节作用，使胰岛移植糖尿病大鼠获得较长时间的存活，为诱导异种胰岛移植免疫耐受提供新的思路和方法?
【参考文献】
Rampino T， Gregorini M， Bosio F， et al. Mesenchymal stromal cells injection reduces acute rejection damage in a rat experimental model of kidney transplantation[J]. G Ital Nefrol， 2011， 28(2):132-134.
Casiraghi F， Noris M， Remuzzi G. Immunomodulatory effects of mesenchymal stromal cells in solid organ transplantation[J]. Curr Opin Organ Transplant， 2010， 15(9):731-737.
Zhang J， Li H， Jiang N， et al. Inhibition of rejection in murine islet xenografts by CTLA4Ig and CD40LIg gene transfer[J]. Chin Med J (Engl)， 2010， 123(21): 3106-3109.
Bartholomew A， Sturgeon C， Siatskas M， et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo[J]. Exp Hematol， 2002， 30(1): 42-48.
Tse WT， Pendleton JD， Beyer WM， et al. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells:implications in transplantation[J]. Transplantation， 2003， 75(8): 389-397.
Blanc LK， Tammik L， Sundberg B， et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimultae mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex[J]. Scand J Immunol， 2003， 57(1): 11-20.
Bartholomew A， Sturgeon C， Siatskas M， et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo[J]. Exp Hematol， 2002， 30(1): 42-46.
Ryan JM， Barry FP， Murphy JM， et al. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection[J]. J Inflamm， 2005， 26(1): 2-8.
Casiraghi F， Azzollini N， Cassis P， et al. Pretransplant infusion of mesenchymal stem cells prolongs the survival of a semiallogeneic heart transplant through the generation of regulatory T cells[J]. J Immunol， 2008， 181(9): 3933-3946.
Wang Y， Zhang A， Ye Z， et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibit acute rejection of rat liver allografts in association with regulatory T-cell expansion[J]. Transplant Proc， 2009， 41(8): 4352-4356.
Aggarwal S， Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J]. Blood， 2005， 105(4): 1815-1821.