作者：王德全，陈思东，杨翌，王卫红，周卫平，姚振江
【摘要】 目的 探讨白细胞介素-1受体拮抗剂基因(interleukin-1 receptor antagonist gene，IL-1RN)第2号外显子+ 8006T/C位点单核苷酸多态性与早发性冠心病之间关系。方法 采用聚合酶链反应和限制酶切法(PCR-RFLP)检测112名早发性冠心病患者和145 例健康对照人群的IL-1RN(+ 8006T/C )位点多态性。结果 早发性冠心病组和正常对照组人群3种基因型以TT型最为常见，其次为TC，CC型较为罕见，其频率依次为90.18%、8.04%、1.79%及80.69%、18.62%和0.69%，两组人群IL-1RN(+8006T/C)位点基因多态性的分布情况存在显著性差异；早发性冠心病组携带等位基因T型和C型频率分别为94.64%、5.36%，而正常对照组人群为88.62%和11.38%，两组比较，P&<0.05。心肌梗死组不携带IL-1RN *C基因型者，是携带IL-1RN *C基因型的3.98倍 ( OR =3.98，95 % CI ∶ 1.11～24.18)。结论 早发性冠心病组和正常对照组人群IL-1RN第2号外显子+8006位点存在T/C多态性，IL-1RN 第2 号外显子+ 8006T/C位点基因多态性与冠心病的发生、发展及该疾病的严重程度密切相关，IL-1RN*C 在其中可能具有保护作用。
【关键词】 白细胞介素-1受体拮抗剂；基因多态性；聚合酶链反应
Abstract:Objective To explore the relation between single nucleotide polymorphisms in the promoter of the IL-1RN (+8006T/C) gene and early onset of coronary heart disease. MethodsUsing the polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method， the IL-1RN(+8006T/C) polymorphisms in 112 patients with early onset of coronary heart disease and 145 healthy volunteers were examined. Results The distribution frequencies of TT ，TC or CC genotypes of early onset of coronary heart disease group and healthy group was different from each other， and the proportions of TT，TC and CC were 90.18，8.04，1.79 and 80.69，18.62，0.69 in patients and healthy volunteers respectively. The frequency of C allele was significantly lower in the patients with early onset of coronary heart disease， there was a significant difference distribution of IL-1RN(+8006T/C) polymorphism， non IL-1RN* C carriers were at increased risk for early onset of coronary heart disease with odds ratios of 3. 98 compared with IL-IRN* C carriers and of 4.09 for myocardial infarction compared with the patients with angina. Conclusions The IL-1RN( + 8006T/C)polymorphism was closely correlated with early onset of coronary heart disease， and affect serum IL-1Ra level， the IL-1RN* C may play a protective role.
Key words:early onset of coronary heart disease; interleukin-1 receptors; genes; polymorphism
近年来，随着生活水平的提高和生活方式的改变，我国冠心病的患病率及病死率都呈现日益增长的趋势，冠心病是中国居民死因构成中上升最快的疾病，而早发性冠心病（发病年龄，男≤55岁，女≤60岁）是临床常见的病症，对我国劳动力构成巨大的威胁。有关冠心病的发病机理目前仍然没有完全阐明，特别是早发性冠心病相关的分子流行病学研究报告尚属少见。
研究表明［1，2］，白细胞介素-1( interleukin-1，IL-1)是具有广泛的生物学活性的多肽物质，参与了高血压、冠心病等心血管疾病的发生和发展过程。编码IL-1基因位于人类染色体2q12-21区带上，该区带包括3种相关基因：IL-1α、IL-1β和IL-1 RN，分别编码IL-lα，IL-1β和IL-1Ra( IL-1受体拮抗剂)。在IL-1 Ra基因第2号外显子区存在一个单核苷酸多态性（SNP），一种由T-C转换所引起的突变，这种突变可能影响IL-1 Ra的表达水平。
白细胞介素-1受体拮抗剂基因（IL-1RN）的单核苷酸多态性（SNP）与早发性冠心病之间的关系如何尚未见报道。
本文通过对早发性冠心病人群和健康对照人群IL-1RN(+8006 )位点SNP的分布进行了观察和分析，探讨IL-1RN基因+8006T/C位点多态性与早发性冠心病的关系，为将来在人群中进行早期筛查、早期预防、临床开展基因治疗和基因芯片的开发等方面工作提供重要依据。
1 对象与方法
1.1 对象
1.1.1 早发性冠心病组（病例组） 2006年1月～2007年8月在广东药学院附属医院、广州医学院附属医院和暨南大学华侨医院就诊的早发性冠心病病人共112例。所有患者均符合1979年WHO的诊断标准，并排除感染、肿瘤和其他免疫性疾病，均未接受皮质类固醇和免疫抑制剂治疗。
1.1.2 健康对照组 145 例对照者选自体检健康人群，血常规、血脂及其他生化指标均在参考范围内，心电图检查正常，均排除肝脏、肾脏、内分泌和心脑血管疾病。所有研究对象均为汉族人群，且无血缘关系。
研究对象签署知情同意书并采血，用自拟的调查问卷进行流行病学调查，调查项目包括个人特征、环境因素和生活习惯等。
1.2 方法
1.2.1 DNA抽提 采集待检者静脉血5 mL，用EDTA抗凝，采用酚-三氯甲烷法提取外周血基因组DNA，-20 ℃保存。
1.2.2 引物合成 扩增IL-1RN第2号外显子区(7977-8150)的片段，引物序列为，P1：5′-TTCTAT CTGAGGAACAACCAACTAGTAGC-3′，P2:5′-AGG ATTAGGACATTGCACCTAG-3′(大连宝生物工程有限公司合成)，其PCR产物为174 bp。
1.2.3 PCR反应条件 PCR反应体系包括DNA模版0.1 μg，2.5 μL 10×PCR Buffer，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物各20 pmol，TaqDNA聚合酶1 U，总反应体积为25 μL，所有试剂均为Promega产品。PCR反应循环参数为:95 ℃预变性反应10 min；94℃变性45 s，56 ℃复性50 s，72 ℃延伸1 min，36个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存，以上反应均在GeneAmp PCR System 2700型基因扩增仪（美国PE公司）上完成。
1.2.4 扩增产物和酶切产物的检测 取PCR产物10 μL，用10 U限制性内切酶AluI酶切，37 ℃孵育3 h，反应终止后，加2 μL缓冲液于8 %聚丙烯酞胺凝胶电泳，溴化乙锭染色法检测，DNA标准物为pGEM3Zf（+）DNA/Hae Ⅲ(华美生物工程公司合成)。电泳条件:室温环境，200 V恒压电泳1 h。电泳后用0.1%的溴化乙锭染色30 min，紫外灯下鉴定结果，并用法国VL自动凝胶成像及分析系流进行成像和分析。
1.3 血清白细胞介素-1受体拮抗剂水平测定
清晨空腹静脉采血2 mL，不加抗凝剂，在室温静放置半小时后，常温3 000 r/min离心10 min，分离血清并于-70 ℃保存待用。用酶联免疫吸附方法测定血清白细胞介素-1受体拮抗剂水平，试剂盒为美国Cytimmune产品，操作按照说明书进行。
1.4 统计学处理
用SPSS 12.0建立数据库并计算两组人群IL-1 RN(+8006)位点基因型及等位基因频率，用χ2检验方法分析各等位基因及基因型频率差异。
1.5 质量控制
研究中所有的实验方法均通过预试验摸索最佳反应条件和反应体系，所涉及的试剂均按操作要求严格执行。PCR测序的结果按5％的比例进行复检，要求复检与初检的结果符合率达到100％。
2 结果
2.1 IL-1RN(+8006T/C) 位点基因多态性
对145例健康对照者和112例早发性冠心病患者进行IL-1RN(+8006T/C) 位点基因多态性观察结果发现，PCR 扩增产物长度为174 bp，经限制性内切酶Alu I 酶切后，在两组人群中共观察到3种基因型：即 TT基因型有2条带(146 bp和28 bp)；TC 基因型有3条带(174 bp、146 bp 和 28 bp) ；CC基因型仅有1条带(174 bp)。
2.2 早发性冠心病组和对照组 IL-1RN(+8006T/C) 位点基因多态性的分布 见表1。
IL-1RN(+8006T/C) 位点基因多态性的基因型及等位基因型在两组人群中的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明其基因频率已达到遗传平衡并具有群体代表性。在两组人群中，该位点基因多态性的基因型分布均以TT纯合子型最为多见，其次为 TC杂合子型，而CC纯合子型较为罕见；其等位基因频率分布以T等位基因最为常见，其次为C等位基因。在IL-1RN(+8006T/C) 位点基因多态性与冠心病风险度的关系分析中可见，不携带等位基因C (IL-1RN *C)基因型，其患冠心病的相对危险度是携带IL-1RN *C基因型的2.2倍（OR=2.20，95%CI 1.04～4.64），其等位基因间的比较也呈相似的结果（OR=2.27，95%CI 1.14～4.50），提示在冠心病的发生和发展过程中，IL-1RN *C可能具有保护作用。
2.3 IL-1RN(+8006T/C) 位点基因多态性在早发冠心病不同疾病状态的比较 见表2。
表1 早发性冠心病和对照组人群IL-1RN(+8006T/C)位点基因多态性的分布情况（略）
TaB.1 Distribution of IL-1RN(+8006T/C) gene polymorphisms in premature coronary disease and control group
早发冠心病组与对照组比较:*P&<0.05
Tab.2 Distribution of IL-1RN *C genetype in premature coronary disease group and control group
由表2所见，早发性冠心病患者根据临床诊断分组后，不携带IL-1RN *C基因型和携带 IL-1RN *C基因型者在心肌梗死组和心绞痛组间的分布存在显著性差异( P&<0. 05)，与心绞痛组比较并计算其OR值发现，不携带IL-1RN *C基因型者，患心肌梗死的相对危险度约是携带IL-1RN *C基因型的3.98倍 (OR=3.98，95 % CI∶1.11～24.18)。
2.4 血清白细胞介素-1受体拮抗剂水平
早发性冠心病组和正常对照组人群携带IL-1RN *C者其血清中血清白细胞介素-1受体拮抗剂水平差异无显著性（P&>0.05），但早发性冠心病组携带IL-1RN *C等位基因者血清白细胞介素-1受体拮抗剂水平（1.422±0.203 μg/L）明显高于不携带者（0.853±0.317 μg/L），两组比较差异有显著性（P&<0.05）。
2.5 白细胞介素-1受体拮抗剂基因多态性与早发性冠心病累及血管数的关系
在112名病例中，有63名患者进行了选择性冠状动脉造影检查，63名患者的血管受累情况与携带IL-1RN *C基因携带情况关系见表3。
表3 IL-1RN *C基因携带情况与早发性冠心病累及血管数的关系情况（略）
Tab.3 The relationship between IL-1RN *C genetype and vessel disease
如表3所见，是否携带IL-1RN *C基因与早发冠心病病人单支血管病变和多支血管病变的病理改变联系无显著性（P&>0.05）。
3 讨论
早发性冠心病的分子流行病学研究目的在于发现生物学危险因素，研究表明［3］，早发性冠心病患者中，很多人有高血压和冠心病家族史，其冠心病家族史的OR为2.14( 95%CI为1.10～4.15)，高血压病家族史的OR为2.07(95%CI为1.18～3.65) 。遗传因素在冠心病特别是早发性冠心病发病中的作用越来越受到重视，尤其是对相关基因克隆及其功能的研究成为国际生物学的热点之一。
早发性冠心病的发病是以动脉粥样硬化形成作为基本的病理过程，影响该过程的很重要因素就是内皮细胞的活化问题。IL-1具有刺激血管内皮细胞活化并以自分泌方式产生 IL-1，而 IL-1可以改变内皮的许多功能：抑制内皮细胞的增殖，诱导内皮细胞表达黏附分子，进而引起单核细胞和淋巴细胞的招募和浸润并黏附到内皮；调节内皮产生促凝活性以促进血栓形成；诱导内皮细胞产生前列腺素和血小板活性因子等血管活性物质，使血流动力学特性发生改变并促进动脉粥样化的形成；参与脂质代谢、增加血管渗透性等。以上资料表明，IL-1与早发性冠心病的发生、发展密切相关。另外，冠状动脉的管壁内皮细胞是IL-1和 IL-1Ra合成的主要场所，而 IL-IRa是 IL-1家族中唯一的内源性拮抗剂，它可与 IL-1竞争结合IL-1受体而有效地拮抗IL-1所引起的上述反应，阻止或减轻动脉粥样化的形成。因此 IL-IRa在冠心病的发生、发展过程中可能具有一定的保护作用。
有资料表明［4］，IL-1RN *C型等位基因与血浆中IL-1Ra的高表达相关，IL-1RN *C型等位基因可能在冠心病的易感性中具有保护作用，在冠心病组和对照组的白细胞介素-1受体拮抗剂基因（IL-1RN）的（+8006T/C）位点基因多态性的分布存在着显著的差异，不携带等位基因（IL-1RN*C）的人群中，冠心病患病风险约是携带（IL-1RN*C）基因型的1.91倍，白细胞介素-1受体拮抗剂基因（+8006T/C）位点基因多态性与冠心病发生和发展具有显著性联系。IL-1RN（+8006T/C）位点的等位基因C与冠状动脉支架术后再狭窄的低发生率也密切相关，可能是IL-1RN*C 促进IL-1Ra的高表达，进一步对IL-1的致病作用起到有效地抑制。
但早发性冠心病人群中，编码IL-1Ra的基因核苷酸多态性变异情况如何尚未见到相关报道。 本研究通过PCR-RFLP 的方法，分析了IL-1RN(+8006T/C) 位点基因SNPs基因型频率的分布差异情况，探讨基因SNPs与早发性冠心病的相关关系，结果发现，与对照组比较，不携带IL-1RN *C基因型者，其患冠心病的相对风险度约是携带 IL-1RN *C基因型者基因型的2.20倍，与心绞痛组比较，患心肌梗死的相对风险度约是3.98倍。IL-1RN(+8006T/C)位点基因多态性与冠心病的发病有密切关系，在早发性冠心病的发生和发展过程中IL-1RN *C基因可能具有保护作用。
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