关于脂质体介导hTERT反义寡核苷酸对HL60细胞增殖及凋亡的影响

　　　　　　作者：关则兵 潘学谊 蔡小燕

【摘要】 目的 研究经脂质体介导转染端粒酶逆转录酶（hTERT）反义寡核苷酸(ASODN)对HL60细胞增殖、凋亡的影响。方法 运用四唑盐比色（MTT）法检测HL60细胞的增殖、Annexin VFITC/PI双标记法细胞早期凋亡流式检测法检测HL60细胞的凋亡。结果 hTERT ASODN组（终浓度10 μmol/L）、脂质体介导hTERT ASODN组(终浓度0.5 μmol/L)均能抑制HL60细胞增殖，诱导HL60细胞凋亡，两组比较差异无显著性。各ASODN组对HL60的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷（终浓度10 μmol/L）（P&<0.01）。结论 脂质体的介导增强了hTERT AS0DN抑制HL60细胞增殖及诱导凋亡的作用效果。脂质体介导hTERT ASODN有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充。
【关键词】 脂质体；端粒酶逆转录酶；反义寡核苷酸；HL60细胞；凋亡
Abstract:Objective To investigate the effects of liposomemediated hTERT ASODN on the proliferation and apoptosis of HL60 cells. Methods To detect inhibition rate of HL60 multiplication by MTT and detect apoptosis by Annexin VFITC/PI double label method with FCM. Results The hTERT ASODN（10 μmol/L）and liposomemediated hTERT ASODN(0.5 μmol/L) all had the inhibitory effects on proliferation and inducing apoptosis of HL60 cells， but there was no significant difference between the two groups. The inhibitory effects on cell proliferation and inducing apoptosis in the cytarabine group was stronger than the others（P&<0.01）. Conclusions The inhibitory effects on cell proliferation and inducing apoptosis of hTERT AS0DN were enhanced by liposome. Liposomemediated hTERT ASODN could be an additional method to treat acute leukemia besides chemotherapy.liposome；telomerase reverse transcriptase；antisense oligodeoxyn
　　Key words:liposome；hTERT；HL60 cell；ASODN；apoptosis
　　 恶性肿瘤的形成与端粒酶活性的升高有关［1］，白血病及其细胞株也存在着端粒酶活性的高表达［2］。由于端粒酶逆转录酶（hTERT）是调节端粒酶活性高低的限速决定因子［3］，故利用hTERT mRNA的反义寡核苷酸(ASODN)抑制端粒酶活性有望成为治疗白血病的手段［4］。但在将外源基因引入靶细胞的过程中，很容易被体内的核酸酶降解，失去治疗作用。为探讨经脂质体介导后，能否提高hTERT ASODN抑制HL60细胞增殖及诱导凋亡的作用，笔者进行了以下研究。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　hTERT ASODN：序列为5′GGAGCGCGCGGC ATCGCGGG3′［4］，由上海Sangon生物工程公司合成，对其进行全硫代修饰及聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化；阿糖胞苷：哈尔滨博莱制药有限公司产品，产品批号：05020701；阳离子脂质体Lipofectin：美国Invitrogen公司产品，产品批号：50503。
　　1.2 细胞培养
　　HL60细胞株培养基为含10%（φ）胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养液，在37 ℃、5％CO2饱和湿度条件的培养箱中培养，2～3 d常规传代换液培养，台盼蓝染色计数，维持细胞活力在90%以上。取对数生长期细胞进行后续实验。
　　1.3 反义核酸脂质体复合物的制备及转染
　　hTERT ASODN加灭菌三蒸水充分溶解，浓度配制为100 μmol/L，-20 ℃冰箱保存备用。按照脂质体说明书，取100 μmol/L ASODN溶液5 μL(3.33 μg)加入不含血清及抗生素的RPMI1640培养液 95 μL，为A液；取阳离子脂质体Lipofectin 20 μL(20 μg)加入不含血清及抗生素的RPMI1640 80 μL，为B液。A、B液分置室温30 min后，轻柔混匀，再置室温15 min，即为反义核酸脂质体复合物。取HL60细胞，5×105/孔。每孔加不含血清及抗生素的RPMI1640培养800 μL，加入反义核酸脂质体复合物200 μL（反义核酸终浓度为0.5 μmol/L），放入 37 ℃ CO2孵箱中转染6 h后进行后续实验。
　　1.4 分组及加药方法
ASODN组：取HL60细胞1×105，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液990 μL、加入的1 mmol/L ASODN溶液10 μL（使其终浓度为10 μmol/L ［4］），培养72 h；脂质体介导ASODN组：取转染后HL60细胞1×105，改换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液1 000 μL，继续培养72 h；阿糖胞苷组：取HL60细胞1×105，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液990 μL、加入阿糖胞苷溶液10 μL（使其终浓度为10　μmol/L，参照文献报道的半数抑制浓度 ［5］），培养72　h；空白对照组（常规培养体系）：取HL60细胞1×105，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液1 000 μL培养72 h。分别培养24 h、48 h、72 h收集(每组做3个平行孔)。
　　1.5 MTT检测
　　取培养的细胞悬液量0.5×105，于培养体系内加入5 mg/mL MTT液20 μL，相同条件下（37 ℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中）培养4 h。离心（1 000 r／min，5 min）后尽量去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，微量振荡器振荡10 min。选择570 nm波长，在自动酶标仪上检测各孔光吸收值(A值）。细胞增殖抑制率（%）=［（1-实验孔A值）/对照组A值］×100%。
　　1.6 Annexin VFITC/PI双标记法细胞早期凋亡流式检测
　　按Annexin VFITC凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）说明书操作。收集细胞于10 mL的离心管中，调整待测细胞密度为0.5×106/mL，取1 mL，800 r/min 4 ℃离心10 min弃去培养液。加入1 mL冷PBS洗1次，800 r/min 4 ℃离心10 min弃去上清，重复加入1 mL冷PBS洗1次，800 r/min 4 ℃离心10 min弃去上清。将细胞重悬浮于200 μL结合缓冲液。分别加入Annexin VFITC 10 μL和PI 5 μL，轻轻混匀，室温下避光孵育15 min或4 ℃反应30 min。加入300 μL结合缓冲液，立即上流式细胞仪检测。

转贴于 1.7 统计学处理
　　数据均采用均数±标准差(±s)表示，使用SPSS统计软件，采用单因素方差分析（F检验）及组间比较t检验，以P&<0.05为差异有显著性。
　　2 结 果
　　2.1 MTT检测细胞增殖抑制率 ASODN组、脂质体介导ASODN组对HL60细胞增殖均有抑制作用，与空白对照组比较，差异有显著性。
　　2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 ASODN组、脂质体介导ASODN组均有增强诱导凋亡作用，与空白对照组凋亡率比较，差异有显著性。表1 脂质体介导hTERT ASODN对HL60细胞增殖抑制的影响与其他3组比较:▲P&<0.01；与空白对照组比较: *P&<0.05；**P&<0.012 脂质体介导hTERT ASODN对HL60细胞凋亡的影响与其他3组比较:▲P&<0.01；与空白对照组相比较:△P&<0.01
　　3 讨 论
　　端粒酶与肿瘤发生相关，在正常人体细胞中导入端粒酶，细胞可获得永生化并形成肿瘤［6］。hTER基因是端粒酶活化的限制性组分，与端粒酶活性直接相关［7］。hTER基因表达于各种肿瘤细胞，白血病及其细胞株也存在着端粒酶活性的高表达，在HL60细胞高表达［8］。阻断hTER基因表达可有效抑制端粒酶活性，达到抑制白血病细胞增殖的目的。
　　ASODN是根据碱基互补配对原则天然存在或通过人工合成的能高度特异性地封闭靶基因表达的一段寡核苷酸分子。ASODN能与细胞表面的受体结合，通过胞饮作用进入胞质和细胞核。但外源性ASODN在体内很容易被核酸酶降解，利用阳离子脂质体包裹外源ASODN，可使其免受核酸酶的降解，并协助ASODN穿透细胞壁进入细胞，提高细胞摄取ASODN的能力。另外，还可抵御核酸酶的作用，延缓ASODN降解。
　　本次实验显示，hTERT ASODN组（10 μmol/L）、脂质体介导hTERT ASODN组(0.5 μmol/L)均能抑制HL60细胞增殖，诱导HL60细胞凋亡，两组间比较差异无显著性。但经脂质体介导的ASODN组的剂量仅为无脂质体介导组的1/20。因此可以推断，脂质体的介导加强了AS0DN转染HL60细胞的能力，并增强其抑制细胞增殖及诱导凋亡作用效果。实验以文献报道的阿糖胞苷的半数抑制量（10 μmol/L）作阳性对照，结果显示，各ASODN组对HL60的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷（P&<0.01），但考虑到脂质体及ASODN均不存在化疗药物强烈的毒副反应，因此，脂质体介导hTERT ASODN有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充。
【

参考文献

】
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