关于HPLC法测定红霉素明胶微球的含量

　　　　　　作者：伍善广 杨帆 潘育方 黄慧 李桃

【摘要】 目的 建立红霉素明胶微球中红霉素含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为DIKMA C18色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相为0.1 mol/L磷酸二氢铵（三乙胺调节至pH6.5）乙腈（体积比67∶33），流速1 mL/min；检测波长210 nm。结果 红霉素质量浓度在0.099 2～0.496 0 mg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系，r=0.999 9；平均回收率为100.1%，RSD=0.95％(n=9)。结论 本文方法可用于红霉素明胶微球的含量检测。
【关键词】 红霉素明胶微球；高效液相色谱法；紫外分光光度法
Abstract:Objective To establish an HPLC method for determining the content of erythromycin in the gelatin microspheres containing erythromycin. Methods DIKMA C18 column (5 μm， 250 mm × 4.6 mm) column was used to analyze the sample by using the mobile phase consisting of 0.1 mol/L ammonium dihydrogen phosphate (adjust to pH6.5 with triethylamine)acetonitrile (67∶33) . The flow rate was 1 mL·min-1 and the detection wavelength 210 nm.Results The calibration curve was linear over the range 0.099 2-0.496 0 mg·mL-1 for erythromycin (r=0.999 9). The recovery through the column was 100.10%(RSD 0.95％， n=9). Conclusions The method is simple， rapid and accurate for the content analysis of erythromycin in the gelatin microspheres.
　　Key words:erythromycin； gelatin microspheres；HPLC
红霉素(erythromycin)是临床上应用广泛的抗生素，是治疗支原体肺炎、军团菌肺炎的首选药物［1］，但在体内分布广泛，有效治疗浓度维持时间短，容易诱发耐药性，且有口服吸收不规则、肝毒性等不良反应［2］。
　　红霉素微球是以可生物降解的明胶为载体，是本实验室通过正交试验优化制备的具有合适粒径的肺靶向性微球［3］。中国药典(2005年版)中红霉素的含量测定采用微生物检定法［4］，此法操作繁琐、费时、影响因素多、结果准确性差。文献报道红霉素及其在制剂中含量的检测方法有紫外分光光度法、高效液相法、高效毛细管电泳法等［5-7］。
　　本文作者曾采用紫外分光光度法测定红霉素微球的含量［5］，取得良好效果。本文采用高效液相色谱法测定红霉素明胶微球含量，并对2种方法进行统计分析，检验2种方法的差异性。
　　1 仪器与试药
　　岛津LC10ATVP高效液相色谱仪（SHIMADZU COPRPORATION），紫外SPD10Avp检测器（SHIMADZU COPRPORATION），HW色谱工作站。pHS25pH计（上海精密科学仪器有限公司），超声波清洗器（天津市考德斯科技有限公司）。
　　红霉素标准品（中国药品生物制品检定所，批号30307200215），乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。红霉素明胶微球(简称EMGMS，自制，批号：20060809、20060812、20060815、20060820、20060822、20060828)。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱： DIKMA C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：0.1 mol/L磷酸二氢铵（三乙胺调节pH 6.5）乙腈（体积比67∶33）；流速1 mL/min；检测波长：210 nm。
　　2.2 溶液的配制
　　精密称取红霉素标准品49.6 mg置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.992 mg/mL的标准品溶液。
　　精密称取红霉素明胶微球172.3 mg(约相当于红霉素23 mg)，充分研磨，显微观察微球完全破坏后，置于容量瓶中加流动相至刻度，超声30 min，放冷，用流动相定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，制成供试品溶液。
　　精密称取空白明胶微球172.4 mg，充分研磨，按“供试品溶液”制备方法制成阴性对照溶液。
　　2.3 系统适应性及方法专属性试验
　　　在选定的色谱条件下，分别注入红霉素标准品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，结果见图1。红霉素拖尾因子为1.26、保留时间约13.1 min，理论塔板数按红霉素计算不低于1 000，与其他组分可基线分离，阴性样品不干扰样品测定。
　　2.4 标准曲线
　　分别精密量取标准品溶液1、2、3、4、5 mL置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别取20 μL进样，记录色谱峰峰面积。以峰面积(A)为横坐标，质量浓度(ρ)为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为:ρ=0.3×10-4A+0.28×10-2，r=0.999 9。结果表明红霉素的质量浓度在0.099 2～0.496 0 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验
　　取供试品溶液在室温放置，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，记录色谱峰峰面积，RSD为0.86%，表明样品溶液在10 h内稳定。
　　2.6 精密度试验
　　取对照品溶液，于10 h内不同时间重复进样5次，记录色谱峰峰面积，RSD为1.41%，表明精密度良好。
　　2.7 回收率试验
　　精密吸取已知浓度的红霉素明胶微球溶液9份，加入一定量的红霉素对照品，配制成高、中、低3种质量浓度的溶液，按“2.2”项方法制成供试液，进样测定，计算回收率，结果平均回收率为100.1%，RSD值为0.95%（n=9）。
　　2.8 重复性试验
　　取同一批微球(批号：20060809)5份，按“2.2”项方法制成供试液，进样，记录色谱图，计算红霉素含量的RSD为1.2％，表明重复性良好。
　　2.9 样品的测定
　　取6批样品，按“2.2”项方法制成供试液，进样测定。并同时按紫外分光光度法进行检测［5］，测定结果见表1。采用统计软件SAS9.0对2种方法的测定结果进行配对资料两样本均数t检验，统计分析结果见表2。从表2可见，2种方法的测定结果差异无显著性(P=0.85，P&>0.05)。表1 紫外分光光度法和高效液相色谱法的测定结果比较表2 统计分析结果

参考文献

［1］ POTHULURI J V， NAWAZ M，CERNIGLIA C E. Environmental fate of antibiotics used in aquaculture［M］//SIKDAR S K，IRVINE R L.Bioremediation: Principles and Practice，Biodegradation Technology Developments. LancasterBasel:Technomic Publishing Co，1998:221-248.

［2］ 陈新谦．新编药物学［M］.14版.北京：人民卫生出版社，1997:78-79．

［3］ ILLUM L， DAVID S S．Targeting of colloidal particles to the bone marrow［J］．Life Sci，1987，40:1553-1560．

［4］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版二部［S］．北京：化学工业出版社，2005：223.

［5］ 伍善广，潘育方，杨帆，等.紫外分光光度法测定红霉素明胶微球的含量［J］.海峡药学，2007，19(10):65-66.

［6］ 朱恩东，茅春新.HPLC法测定红霉素含量［J］.中国医学研究与临床，2004，16(2):39-40.

［7］ 孔小轶，车宝泉，田红昭．高效毛细管电泳法测定红霉素的含量［J］．首都都医药，1999，6(7)：18．

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