染锰大鼠脑匀浆生化浅析

　　　　　　 作者：吴燕明，张德兴，贺新红，陆志根

【摘要】 目的 了解锰对脑组织相关酶类活性的影响及可能的细胞保护机制。方法 大鼠经饮水连续染锰（MnCl2·4h3O 0.5 g/L和5.0 g/L）60 d后，应用荧光光度比色法测定新鲜脑组织匀浆的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、胆碱酯酶（ChE）、单胺氧化酶（MAO）、氧化亚氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、蛋白质（PRO）含量，并设生理盐水对照组。 结果 与对照组比较，高、低剂量组的ALT、AST、ALP、ChE、MAO、NOS活性和MDA含量明显升高；而SOD活性和GSH含量则显著降低。 结论 过量锰沉积可影响脑组织多种酶类的正常代谢，对脑组织造成毒性损害。
【关键词】 锰；脑组织；酶；毒性；生化分析
Abstract:Objective To study the effects of manganese on enzymes and possible cellular defense mechanism. Methods Male SD rats were given drinking water containing manganese chloride (MnCl2·4h3O 0.5 g /L and 5.0 g/L respectively) for 60 days. At the end of experiment， all the rats of the manganeseexposed groups and control group were decapitated after anaesthesia with 2% sodium phenobarbitone intraperitoneally， the brains were removed and activities of alanine aminotransferase（ALT）， aspartate aminotransferase（AST）， alkaline phosphate（ALP）， cholinestarase（ChE）， monoamine oxidase（MAO）， superoxide dismutase（SOD）， nitric oxide synthase（NOS）， and levels of glutathione（GSH），maleic dialdehyde（MDA），and proteins were biochemically analyzed. Results Compared with the control group， activities of ALT， ALT， ALP， ChE， MAO， NOS and MDA level increased， but the SOD activity and GSH level decreased significantly in 2 manganeseexposed groups. Conclusion Manganese induced toxic effects on brains in rats by interfering with the metabolism of related enzymes.
　　Key words:manganese; brain; enzymes; toxicity
　　 锰是中枢神经系统正常生理活动所必需的微量元素，但过量的锰可产生神经毒性，导致神经细胞不可逆性损害，临床多呈类帕金森氏综合征表现［1，2］。透过血脑屏障的锰，有选择性地沉积在包括锥体外系结构在内的广泛靶区，靶区内神经元的线粒体则是其攻击的靶点［3］。锰的神经毒性机制已经从神经元的能量代谢、自由基和巯基耗竭、DA自氧化、兴奋性毒性、线粒体损伤等方面进行了研究，这其中涉及到神经细胞内多酶体系的代谢过程。本研究通过测定连续锰染毒大鼠脑匀浆中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、胆碱酯酶（ChE）、单胺氧化酶（MAO）、氧化亚氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、蛋白质（PRO）含量等指标的变化，探讨锰对脑部神经细胞相关酶代谢的影响，为锰的神经毒性及其机制提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　二氯化锰（MnCl2·4h3O，分子量197.91，分析纯，纯度不低于99.0%，天津市福晨化学试剂厂）；ALT、AST、ALP、ChE、MAO、SOD、NOS、SOD 、GSH、MDA、PRO测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；主要仪器：721分光光度计（上海第三分析仪器厂）、HH恒温水浴箱（江苏金坛市金成教育仪器厂）、802 EPPENDOF 离心机（北京安亭仪器厂）。
　　1．2 方法
　　1．2．1 动物处理 健康雄性SD大鼠36只，体质量130～150 g，广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤20030002），粤监证字2006A015。随机分成3组，即对照组、低剂量染锰组和高剂量染锰组，每组12只，分笼饲养，光照时间为12 h。染毒途径:采用饮用水中加入二氯化锰方式进行，即将氯化锰溶于蒸馏水中（新鲜配制），连续染毒60 d，染毒剂量为低剂量染锰组0.5 g/L、高剂量染锰组5.0 g/L，对照组则供用蒸馏水。
　　1．2．2 脑脏器系数的检测 于实验结束日，称体质量，经2%(ρ)戊巴比妥钠腹腔内麻醉（2 mL/kg体质量）后，立即断头、开颅、冰浴上取全脑，去除脑膜和血污，天平称量脑重。计算脑重/体质量比值（以每100 g体质量计算）作为脑的脏器系数。
1．2．3 全脑匀浆生化分析 取脑去膜称重后，即依照试剂盒提供的方法制成全脑匀浆，取其上清液，用721分光光度计（上海第三分析仪器厂）比色法分别测定ALT（赖氏法）、AST（赖氏法）、ALP、ChE、MAO、SOD（羟胺法）、NOS及GSH、MDA（TBA法）和PRO（考马斯亮蓝法）的含量。
　　1.3 统计分析
　　所有实验数据用(±s)表示，采用SPSS11.5软件进行统计分析。用Scheffs Test方法进行组间均数比较，以P&<0.05为差异有显著性。
　　2 结 果
　　2．1 锰对脑脏器系数的影响
　　各组大鼠在实验期内活动正常，未出现明显的中毒和不良反应，生长发育情况无明显差异。脑脏器系数测定结果分别为：对照组0.75±0.06 、低剂量组0.71±0.05 、高剂量组0.72±0.06，三组之间差异无显著性（P&>0.05）。
　　2．2 锰脑匀浆ALT、AST、ALP、ChE、MAO、SOD、NOS活性及GSH、MDA和PRO含量的影响
　　三组大鼠脑匀浆的PRO含量无明显差异（P&>0.05）;ALT、AST、ALP、ChE、MAO、NOS活性及MDA含量低剂量组明显高于对照组，高剂量组又明显高于低剂量组；但SOD活性和GSH含量低剂量组明显低于对照组，而高剂量组又明显低于低剂量组。见表1。表1 锰对大鼠脑匀浆ALT、AST、ALP、ChE、MAO、NOS、SOD活性及GSH、MDA和PRO含量的影响
　　3 讨 论
　　生物体内、外锰接触的研究均证实，体内过量的锰可透过血脑屏障沉积于广泛脑区，对神经元造成不可逆性损害［4，5］。锰对神经元的毒性机制之一，与影响神经细胞的能量代谢及胺类神经递质的合成与释放有关。锰对线粒体有特殊亲和力，大量的锰积蓄于线粒体内可抑制线粒体三羧酸循环、氧化磷酸化和呼吸链等一系列重要酶系，干扰能量代谢并妨碍脑组织儿茶酚胺代谢代程，导致DA能神经元变性和突触中介质传导功能紊乱［6］。MAO是DA降解过程中的限速酶，可催化单胺类物质氧化脱胺成为醛，DA通过MAO降解而失活。本研究结果显示，高、低剂量染锰组大鼠脑匀浆中MAO活性明显高于对照组，提示锰在脑区的沉积激发了MAO活性的提高，是其导致脑DA神经元损伤的分子机制之一。

　　脂质过氧化是锰毒性损伤作用的机制之一。有研究表明，锰引起生物膜不饱和脂肪酸过氧化作用增强，脂质过氧化产物生成增加，导致生物膜结构受损、功能紊乱，神经细胞变性死亡［7］。MDA是脂质过氧化的代表性终产物，它的含量反映脂质过氧化损害情况的细胞氧化应激程度；SOD是需氧生物体内一种含不同金属元素的酶蛋白，是唯一可以消耗过氧化物自由基的酶，测定其活性可直接了解机体抗氧化能力水平；GSH 是网络抗氧化剂中最丰富的一种含硫基非蛋白质化合物，可保护含硫基的重要蛋白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损害。GSH还是低分子清洗剂，可以清除超氧阴离子、过氧化氢、脂过氧自由基等。因此，GSH含量的多少是衡量机体抗氧化能力的又一重要指标。本研究结果中，与对照组相比，高、低剂量组大鼠脑匀浆的MDA明显升高，而SOD、GSH则显著下降，揭示锰抑制了SOD活性和GSH对自由基的清除作用，导致了过氧化产物的堆积，引发神经细胞的损害。
　　锰通过NO介导的神经毒性近年特受关注。姜岳明等［8］ 研究证明，锰能诱导NOS合成，引起内源性NO大量增加。过量的NO是一种细胞毒分子，可通过干扰能量代谢，抑制ATP合成等途径，造成组织细胞的变性坏死；Jacinth等［9］的研究揭示，体内过量的NO还可通过以下机制损伤DNA：致DNA碱基脱氨基、致DNA氧化、致亚硝氨含量增加、抑制DNA损伤的修复。本研究结果中，高、低剂量染锰组的NOS均比对照组明显升高，这为锰通过NO介导的神经毒性分子机制提供了进一步的证据。
【

参考文献

】
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