关于反相高效液相色谱法测定益气降糖胶囊中葛根素的含量

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【摘要】 目的 建立益气降糖胶囊中葛根素的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×200 mm）；甲醇0.5％醋酸（体积比19∶81）为流动相；流速1.000 mL/min，检测波长250 nm，柱温35 ℃。结果 葛根素的进样量在0.053 5～0.535 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r＝0.999 8；平均回收率为96.32％，RSD为0.63％。结论 本方法简单、可靠、专属性强，可以作为控制益气降糖胶囊质量的方法。
【关键词】 益气降糖胶囊；葛根素；高效液相色谱法
Abstract:Objective To establish an HPLC method for analyzing the content of puerarin in Yiqijiangtang capsule.Methods Samples were analyzed on an LUNA ODS C18 column（5 m，4.6 mm 200 mm）by using methanol 0.5％HAc（19∶81） as mobile phase. The flow rate was 1.0 ml/min and the detecting wavelength 250 nm.Results The linear range of puerarin was 0.0535-0.535 μg(r＝0.9998). The average recovery was 96.32％（RSD=0.63％）. Conclusion The method is reliable， accurate and specific. It can be used for the quality control of Yiqijiangtang capsule.
　　Key words:Yiqijiangtang capsule；puerarin；HPLC
　　 益气降糖胶囊由黄芪、天花粉、葛根、山药、茯苓、泽泻、山茱萸等二十几味中药组成，具有滋阴清热、益气生津、敛气固精的功效，适用于糖尿病及糖尿病引起的全身综合征［1］。制剂处方中主药葛根的有效成分为葛根素、黄豆苷、黄豆苷元等黄酮类成分，其中葛根素的含量最高。为了有效控制该药品的质量，根据新药审评有关规定，本文建立了测定益气降糖胶囊中葛根素含量的高效液相色谱法，结果分离度好、重现性好、灵敏度高，可作为控制益气降糖胶囊质量的方法。
　　1 仪器与试药
　　仪器：Agilent1100高效液相色谱仪（SPD10AVP紫外检测器；N2000数据处理系统）；超纯水器（Mililpore）；DL360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。
　　试药：葛根素对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供，批号：110756200305 ）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；D101大孔吸附树脂（安徽蚌阜天星树脂有限公司）；中性氧化铝（100～200目，青岛海洋化工厂）；益气降糖胶囊样品（批号061205，061208，061211）以及阴性样品（自制）。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱为DiamonsilTM十八烷基键合硅胶柱(200 mm×4.6mm， 5 μm)；柱温为35 ℃；流动相为甲醇0.5％醋酸（体积比17∶83），流速1.0 mL/min；检测波长为250 nm；进样量为10 μL。理论塔板数以葛根素计不得小于5 000， 葛根素与其他峰的分离度应良好。
　　2.2 溶液的制备
　　2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品13.37 mg，置10 mL量瓶中，加体积分数为30％的乙醇溶解并定容，即得质量浓度为1.337 mg/mL的对照液，摇匀。精密吸取上述对照液1 mL置10 mL量瓶中，用体积分数为30％的乙醇稀释至刻度，即得质量浓度为133.7 μg/mL的对照品母液。精密吸取上述对照品母液2 mL置10 mL量瓶中，用体积分数为30％的乙醇稀释至刻度，即得质量浓度为26.74 μg/mL的对照品溶液。
　　2.2.2 供试品溶液的制备 取本品内容物1 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精确加入体积分数为30％的乙醇20 mL，称重，超声提取（功率250 W，频率33 kHz）40 min，放冷，再次称重（用体积分数为30％的乙醇补足减失的重量），离心，倾出上清液，过滤得滤液。精确吸取该滤液10 mL，水浴蒸干溶剂，残渣加水15 mL使溶解，通过已处理好的D101大孔吸附树脂柱（1.5 cm×8 cm，顶端加入5 g中性氧化铝，树脂层与氧化铝层用脱脂棉隔开），先以水150 mL洗脱，再以体积分数为50％的乙醇150 mL洗脱。收集乙醇洗脱液，水浴蒸干溶剂，残渣加体积分数为30％的乙醇溶解并定容于5 mL量瓶中，摇匀，以微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方工艺取各味药材（缺葛根）制成空白样品，并按“2.2.2”项下制备阴性样品溶液。
　　2.3 测定方法
　　分别吸取对照品溶液和供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。实验结果表明：阴性样品溶液在与对照品相应的保留时间处，无色谱峰出现，表明方中其余各药味对葛根素色谱峰测定无干扰。结果见图1。
　　2.4 线性关系考察
　　分别精密吸取质量浓度为0.267 4 mg/mL的对照品溶液0.2、0.4、0.8、1、1.4、1.8、2 mL于10 mL量瓶中，用体积分数为30％的乙醇稀释至刻度，即得不同质量浓度的对照品溶液，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以峰面积（A）为纵坐标，相应的进样质量（m）为横坐标，绘制标准曲线，葛根素回归方程为A=4.8×106 m+0.75×103，r＝0.999 8，表明葛根素在0.053 5～0.535 μg质量范围内与峰面积呈良好线性关系。
　　2.5 精密度试验
　　取质量浓度为26.74 μg/mL的葛根素对照液10 μL，重复进样6次，测得峰面积RSD为0.26％，表明仪器精密度良好。
　　2.6 稳定性试验
　　取同一批供试品（批号：061205）溶液，分别0、2、4、6、8、10、12 h进样，按上述色谱条件测定，计算葛根素含量，求得RSD为0.68％，表明样品中的葛根素在12 h内测定结果稳定。
　　2.7 重复性试验
　　取同一批号益气降糖胶囊样品（批号061205）6份，按“2.2.2”制备溶液，进行测定，测得葛根素的平均含量为0.0288%，RSD为2.72％（n＝6）。
　　2．8 回收率试验
　　取同一批号（批号061205）已知含量的益气降糖胶囊样品6份，每份约0.5 g，精密称定，置20 mL量瓶中，分别加入质量浓度为133.7 μg/mL的葛根素对照品溶液1 mL及适量体积分数为30％的乙醇，按“2.2.2”项方法操作，测定含量，并计算回收率。结果见表1。

转贴于 2.9 样品含量测定
　　分别取益气降糖胶囊样品3批（批号061205，061208，061211），按“2.2.2”制备供试品溶液，进样测定，结果测得葛根素含量分别为0.285、0.270、0.272 mg/g。 表1 回收率试验结果
　　3 讨 论
　　3.1 本制剂药味较多，制剂成品中葛根素的含量低，且测定干扰大，因此样品的前处理尤为关键。在样品溶液制备过程中，参考文献［2-5］，考虑采用体积分数为30％的乙醇或甲醇超声提取的方法，由于甲醇提取液HPLC图中的干扰组分多，葛根素无法达到基线分离，故采用体积分数为30％的乙醇提取并进一步精制浓缩。参考文献［6］，将体积分数为30％的乙醇提取液采用大孔吸附树脂纯化，对树脂种类、洗脱剂等进行了研究，最终确定采用D101大孔树脂作为吸附剂，依次用水及体积分数为50％的乙醇洗脱，达到了浓缩精制的目的。
　　3.2 试验过程中发现，单独使用大孔吸附树脂纯化所得的洗脱液中固体物较多，难以用少量的溶剂溶解定容。在大孔树脂柱上加适量中性氧化铝预先吸附上样液后，效果较为理想。氧化铝可以吸收大量杂质，但不影响葛根素的回收率，说明葛根素没有被中性氧化铝吸附。
　　3.3 考察了甲醇0.1％磷酸（体积比26∶74）、乙腈水（体积比15∶85）、甲醇水（体积比20∶80）、甲醇0.5％醋酸（体积比19∶81）等流动相，以甲醇0.5％醋酸（体积比19∶81）的保留时间较为适宜，且分离度良好，其余几种条件葛根素保留时间短，分离度差。另外，对样品超声处理时间进行了考察，结果表明样品超声时间30　min以上，被测组分含量不再增加，说明超声时间30　min以上即可，故将样品处理的超声时间定为40　min。

参考文献

［1］ 李茜.李书义治疗糖尿病的经验［J］.中国中医药杂志，2004，2（5）：283-284.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京：化学工业出版社，2005.

［3］ 曹雪慧，刘晶晶.反相高效液相色谱法测定颈通颗粒中葛根素的含量［J］.时珍国医国药，2007，18（4）：881-882.

［4］ 梁军，郭卫东，高睿.冠脉宁软胶囊中葛根素含量测定［J］.辽宁中医杂志，2006，33（12）：1619-1620.

［5］ 邹安华.高效液相色谱法测定心康胶囊中葛根素的含量［J］.白求恩军医学院学报，2007，5（1）：33-34.

［6］ 鄢贵龙.大孔吸附树脂对葛根素吸附行为的研究［J］.食品工业科技，2007，28（1）：63-65.