平菇多糖提取工艺优化研究

　　　　 作者：吴宏华 王怡 钱磊 张春椿 陈微娜

【摘要】 ［目的］优化水提法提取平菇多糖的工艺，为平菇多糖的提取提供一种简单有效的方法。［方法］通过单因素试验和正交试验对水提法提取平菇多糖的工艺进行了研究，考察料液比、提取时间、提取温度三个因素对平菇多糖提取率的影响，并以正交试验设计优化工艺条件。［结果］平菇多糖的最佳提取工艺条件为料液比1∶35、提取时间3h、提取温度90℃。在此条件下得率可达2.84%。［结论］该方法简便、价廉、准确、灵敏度高，适合于平菇多糖的提取。

【关键词】 平菇多糖；正交试验；制药工艺

　　Abstract: ［Objective］ In order to optimize the best condition for the water extraction process of Polysaccharides from Pleurotus ostreatus. ［Methods］The single factor experiments were conducted， in which， the effects of radio of liquor to solid， irradiation time， temperature were studied separately. The orthogonal experiments were conducted to find out the appropriate operating conditions. ［Results］ The appropriate operating conditions are as follows: the radio of liquor to solid is 1∶35.The irradiation time is 3h. and the temperature is 90oC. Under these conditions the average yield of Polysaccharides is 2.84%. ［Conclusion］It is an ideal means for extracting Polysaccharides from Pleurotus ostreatus， with short time， less cost and sensitivity.

　　Key words: Pleurotus ostreatus Polysaccharide; orthogonal test; pharmaceutical technique

　　平菇( Pleurotus ostreatus)又名白平菇、侧耳，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口磨科，是广泛栽培的食用菌之一［1］。中医研究认为平菇性味甘、温，具有追风散寒、舒筋活络的功效。常用于治疗腰腿疼痛、手足麻木、筋络不通等病症。长期食用平菇，可以降低血压、降低胆固醇含量、防止血管硬化，对更年期综合症有明显的调节作用，并对超氧阴离子自由基、羟基自由基均具有明显的清除作用［2］。目前对平菇多糖的生物活性已进行了相关研究，但对平菇多糖的分离提取还无系统的研究结果。因此，本文通过单因素试验和正交试验对水提法提取平菇多糖的工艺进行了研究，探索了水提法提取平菇多糖的最佳提取工艺条件，为平菇进一步的开发利用提供一定的参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　平菇为市售，经浙江中医药大学熊耀康教授鉴定确认为层菌纲伞菌目口磨科平菇(Pleurotus ostreatus)的子实体。葡萄糖、苯酚、硫酸、无水乙醇等均为分析纯，蒸馏水。

　　1.2 仪器

　　ZJ2020A型恒温干燥箱(浙江省诸暨市实验仪器厂)；万分之一电子分析天平（德国赛多利斯）；R201旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；电子恒温不锈钢水浴锅（上海中新医疗设备有限公司）；UV2600紫外分光光度计（上海优尼科）；大容量低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 提取方法

　　平菇洗净烘干后适度粉碎，精密称取平菇3.0g，放入圆底烧瓶，设定料液比、提取时间、提取温度进行回流提取，提取液真空抽滤，取滤液，浓缩。滤液浓缩后加无水乙醇至醇沉浓度为80%，静置过夜，4000r/min离心5min，去除上清液，得沉淀即为平菇多糖。

　　1.3.2 含量测定方法

　　本实验采用苯酚硫酸法，以葡萄糖为标准品测定平菇多糖含量［3］。

　　1.3.2.1 对照品溶液的制备

　　准确称取干燥至恒重的葡萄糖粉末10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

　　1.3.2.2 供试品溶液的制备

　　将1.3.1所得的多糖沉淀加水溶解，定容至100ml容量瓶中，摇匀，精密量取1ml，定容至25ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

　　1.3.2.3 最大吸收光波长的确定

　　吸取一定量的标准葡萄糖对照品溶液，置于比色管中，加水至2ml，加1ml 5%苯酚后，立即加入5ml浓硫酸并混匀， 静止10min，摇匀，室温放置20min同时取2ml水进行上述同样操作，作为空白对照。样品溶液分别于450～550nm处测吸光度，确定其最大吸收峰所对应的波长。根据实验测定，当吸收光波长为490nm时，样品溶液的吸光度最大，所以本实验选取吸收光波长为490nm。

　　1.3.2.4 标准曲线的绘制

　　分别精密吸取葡萄糖标准溶液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0 ml于比色管中，各以水补至2.0 ml，然后加入5％苯酚1.0 ml及浓硫酸5.0ml混匀，静止10min，摇匀，室温放置20min后于490 nm测定吸光度，以2.0 ml水按同样显色操作为空白，以多糖浓度为横坐标，测定的吸光度值为纵坐标，得标准曲线y= 6.9151x0.0017，r=0.9992。

　　1.3.2.5 多糖得率计算

　　多糖得率=葡萄糖浓度×稀释倍数×原液体积/子实体干重×100 %

　　1.3.3 单因素考察

　　1.3.3.1 考察料液比对提取率的影响

　　精确称取平菇3.0g6份，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35在提取时间3h，提取温度90℃，提取2次，提取液真空抽滤，取滤液，浓缩。滤液浓缩后加无水乙醇至醇沉浓度为80%，静置过夜，4000r/min离心5min，去除上清液。将多糖沉淀加水溶解，配成供试品溶液，用苯酚硫酸法测定平菇多糖含量。

　　1.3.3.2 考察提取时间对提取率的影响

　　精确称取平菇3.0g6份，提取时间分别设定为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，在料液比为1∶30，提取温度90℃，提取2次，提取液真空抽滤，取滤液，浓缩。其余步骤同“1.3.2.1”。

　　1.3.3.3 考察提取温度对提取率的影响

　　精确称取平菇3.0g6份，提取温度分别设定为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，在料液比1∶30，提取时间3h，提取2次，提取液真空抽滤，取滤液，浓缩。其余步骤同“1.3.2.1”。表1 正交试验因素和水平（路）

　　1.3.4 提取条件优化

　　根据单因素试验结果，选取料液比、提取时间、提取温度3项作为考察因素，在各因素最佳值附近分别取3个水平进行正交试验，以多糖得率为正交试验的检测指标，优化提取条件。
　　
　　1.3.5 工艺验证

　　采用优化筛选后的工艺技术路线重复实验3次，计算多糖提取率，考察工艺技术路线的稳定性。

　　2 结果与分析

　　2.1 料液比对提取率的影响

　　料液比是影响多糖提取率的关键因素之一。若其他提取条件相同，不同加水量对多糖得率的试验结果如图1。由图1可知平菇多糖提取率随料液比的增大而提高，多糖提取率在料液比1∶20至1∶30明显提高，料液比在1∶30至1∶35之间又有所下降。因此在正交试验中，料液比选取1∶25、1∶30、1∶35三个水平。

　　2.2 提取时间对提取率的影响

　　提取时间对多糖提取率的影响较大。若其他提取条件相同，不同提取时间对多糖得率的试验结果如图2。由图2可知，平菇多糖提取率随提取时间加大刚开始上升较大，至提取2.0h时趋于稳定。因此在正交试验中，提取时间选取2.0h、2.5h、3.0h三个水平。

　　2.3 提取温度对提取率的影响

　　提取温度也是影响多糖提取率的直接因素之一。若其他提取条件相同，不同提取时间对多糖得率的试验结果如图3。由图3可知，多糖提取率在为60℃至70℃时有明显提高，到达70℃后增长缓慢，90℃到达最高点，100℃又略微有所下降。因此在正交试验中，提取温度选取80℃、90℃、100℃三个水平。

　　2.4 提取平菇多糖最佳条件的选择

　　通过以料液比、提取时间、提取温度作为考察因素，按L9 (34) 正交设计，以粗多糖得率为考察指标，进行正交试验，结果见表2、表3。表2 水提平菇多糖正交试验结果（略）表3 正交方差分析表（略）

　　2.4.1 直观分析

　　从表2 可以看出，3个因素中以料液比极差最大，它对多糖得率影响最大，随着料液比的增加而提高。提取温度对多糖得率影响也较大。提取时间对多糖得率的影响最小，随着时间的延长，多糖得率1～2h 提高较快，2～3h 提高较缓。根据极差的大小初步判断，影响平菇多糖得率因素的大小分别是: 料水比>提取温度>提取时间。通过试验结果直观分析可以得出，提取红平菇子实体多糖的最优工艺组合为料水比1:35，提取温度90℃，提取时间3h，提取次数2次。

　　2.4.2 方差分析

　　通过方差分析可以得出，料液比在3个因素中达到了显著水平，在进行提取时应当高度重视。而提取时间和提取温度远远小于显著水平，在提取时可以适当缩短提取时间，提高效率，从而节约能源增加效益。

　　2.5 工艺验证

　　采用优化筛选后的工艺技术路线重复实验3次，计算多糖提取率，结果如表4。表4 最佳工艺的验证实验（略）

　　3 讨论

　　水提法是平菇多糖提取方法中研究和应用最多的一种方法，该方法简便、价廉、效果较好。本文通过对料液比、提取时间、提取温度的考察，探索了水提法提取平菇多糖最佳提取工艺条件。其最佳工艺条件为:料水比1∶35 ，提取温度90 ℃，提取时间3h，提取次数2次。提取多糖的工艺流程为:平菇子实体→烘干粉碎→加水调配→热水浸提→过滤→浓缩→乙醇沉淀→离心→干燥→粗多糖。

　　目前多糖的含量测定方法有苯酚硫酸法、3，5二硝基水杨酸比色法、蒽酮硫酸法等。经郝强［4］研究以苯酚硫酸法为测定菌类多糖最理想的方法，此法简单、快速、灵敏。本研究对苯酚硫酸法通过方法学的考察，证明该法测定平菇多糖精密度高、稳定性和重复性好，适用于平菇多糖的测定。

　　料液比对多糖得率影响最大，随着料液比的增加而提高。因为料液比增大， 提取过程中两相浓度差相应增大，传质速度加快，多糖在溶剂中的量不断增加。当料液比增加到一定程度后，虽然两相中有效成分的浓度差依然存在，但传质动力增加不大，所以多糖提取率增幅不明显。提取温度对多糖得率影响也较大，随着温度的升高而增大，温度高于100℃后得率又有所下降。因为温度过低，溶剂的渗透能力和溶解能力降低，多糖不能有效溶出；温度过高，导致多糖裂解，从而使多糖得率大幅度下降［5］。

参考文献

　［1］王立泽.食用菌栽培［M］.合肥:安徽科学技术出版社，1993:8297.

　　［2］程超，李伟.平菇多糖的提取条件及其沉淀特性研究［J］.研究与探讨， 2005，(8):9294.

　　［3］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.杭州:浙江大学出版社，1999:1112.

　　［4］郝强.酸提香菇多糖的提取分离、结构鉴定及抗氧化活性研究［D］.华中农业大学，2008.

　　［5］王卫国，赵永亮，韩山宝.香菇多糖分离纯化技术研究［J］.中国食用菌，2002，21(2):3032.